PDX Tümör Hücrelerini Etiketlemek için Transdüksiyon: Lentivirus İfade Eden Floresan İşaretleyicinin İn Vitro Tümör Hücresine Sokulması

Özet

Kaynak: Hanna, C., et al. Tümör Büyümesi ve Metastaz Çalışmaları için Meme Kanseri Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin İzlenebilir Raportörlerle Etiketlenmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Aşağıdaki videoda, yeşil floresan protein ve lusiferaz raportörlerini tümör hücresine in vitro olarak sokulan lentivirüs eksprese eden PDX tümör hücrelerini etiketlemek için kullanılan bir transdüksiyon tekniği açıklanmaktadır.

Protokol

1. PDX'ten Türetilmiş Tümör Hücrelerinin Transdüksiyonu

1. Ayrışmış tümör hücrelerini 300 g x 5 dakikada santrifüjleyin ve 2 ml mamosfer ortamında yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı hücreleri sayın (Sindirilmiş hücreleri 5 ml'lik yıkama tamponunda yeniden askıya alın ve tripan mavisi dışlamasını kullanarak hem canlı hem de canlı olmayan hücreleri sayın. Kısaca, 50 μl hücre ve 50 μl tripan mavisini karıştırın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri hariç tutan tripan mavisini sayın).
2. 8 μg/ml polibren (ml ortam başına 2 μl stok polibren) içeren 10 ml mamosfer ortamı hazırlayın.
3. 2 x 10⁵ canlı tümör hücresi için gereken hacmi belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve peleti 2 ml polibren içeren ortamda yeniden süspanse edin. Plaka 2 x 10 6 oyuklu ultra düşük yapışmalı doku kültürü plakasında kuyucuk başına⁵ canlı tümör hücresi.
   not: Bu, bir lentiviral vektör ile transdüksiyon için gereken optimal hücre sayısıdır.
   Dikkat!Lentiviral partiküller ve lentiviral partiküllerle kullanılan tüm sarf malzemeleri, rekombinant DNA biyolojik tehlikeleri için kurumsal prosedürler izlenerek ele alınmalıdır.
   not: Primer meme hücrelerinin lentiviral transdüksiyonu, miyoepitelyal hücreleri güçlü bir şekilde destekler, bu da luminal hücrelerin zayıf etiketlenmesine ve etiketleme sırasında tümör hücrelerinin alt popülasyonlarının seçilmesine neden olabilir.
4. Viral partiküllerin farklı birincil hücre alt popülasyonlarına bağlanmasını artırmak ve bu potansiyel yanlılığı düzeltmek için virüsü transdüksiyondan önce 1 saat boyunca 37 ° C'de 200 mU / ml nöraminidaz ile inkübe edin.
5. PDX ile ayrışmış hücreler Lin+ fare hücrelerinden tükenmişse veya EpCam + hücrelerinde zenginleştirilmişse, 10 MOI'de (2 x 10⁵ canlı hücre için 6 x 10 6 TU) lentiviral partiküller ekleyin. Zenginleştirilmemiş PDX ile ayrışmış hücreler kullanılıyorsa, 30 MOI'de (2 x 10⁵ canlı hücre için 6 x 10⁶ TU) lentiviral partiküller ekleyin.
   not: Artan MOI, ham ekstraktlarda büyük miktarlarda döküntü ve ölü hücrelerin varlığında bile verimli transdüksiyona izin verir. Canlılık ve iletim verimliliği için bir kontrol görevi görmesi için etiketlenmemiş hücrelerle bir tane iyi tutun.
6. Virüsü hücrelerle karıştırmak için girdap. 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 96 saate kadar inkübe edin. Transfeksiyondan 24 saat sonra 500 μl taze mamosfer ortamı ekleyin. Hücreler plakalara yapışmaz, ortamı aspire etmez.

2. İmmün Hastalığı Baskılanmış Farelerde Transdüksiyon Verimliliğinin ve Etiketli Hücrelerin Yeniden İmplantasyonunun Değerlendirilmesi

1. 10X büyütmede bir floresan mikroskobu kullanarak her 24 saatte bir izlenebilir işaretleyicinin (GFP) ifadesini izleyin.
   not: GFP ekspresyonu enfeksiyondan 24 saat sonra gözlenebilir, ancak çoğu PDX'te GFP ekspresyonu 72 saat sonra açıkça görülebilir (Şekil 1).
2. Toplam kuyu içindeki GFP + hücrelerinin yüzdesini değerlendirerek transdüksiyonun verimliliğini tahmin edin.
   not: Kültürler tümör hücreleri, rezidüel stromal hücreler ve çeşitli derecelerde ölü hücreler içerdiğinden, konakçı bir fareye %10 kadar düşük GFP + hücresi içeren kuyucuklar implante edilebilir.
3. Transdüksiyonlu hücreleri 6 oyuklu plakalardan 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Geride kalan tüm hücreleri toplamak için kuyuya 1 ml mamosfer ortamı ekleyin. Buzun üzerine yerleştirin.
4. Transdüksiyon hücrelerine 10 ml HBSS/hepes ekleyin ve 300 x g'da 5 dakika, 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve buz üzerinde 50 μl bazal matris ekstraktı (BME) içinde yeniden süspanse edin.
   not: BME alikotları kullanımdan 1-2 saat önce buz üzerinde çözülmelidir. BME oda sıcaklığında katılaşacaktır; Her zaman buz üzerinde tutun.
5. BME'ye gömülü hücreleri 0.5 ml'lik bir insülin şırıngasına yükleyin, buz üzerinde tutun ve NSG farelerine yeniden implantasyon için hayvan tesisine getirin.

Sonuçlar

Şekil 1: Ayrışmış PDX Hücrelerinde Transdüksiyon Verimliliğinin İzlenmesi. A) pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentiviral partikülleri ile transdüksiyondan 24 saat sonra insan epitel hücreleri için zenginleştirilmiş PDX ile ayrışmış hücreler (Lin+ tükenmesi). B) pHAGE-EF1aL-lusiferaz-UBC-GFP-W ile transdüksiyondan 72 saat sonra, epitel hücre zenginleştirmesi olmadan ayrı bir deneyden PDX ile ayrı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM/F12 (1:1)	Klon	SH30023.01
bFGF (İngilizce)	BD Biyolojik Bilimler	354060
EGF (Türkçe)	BD Biyolojik Bilimler	354001
Heparin	Sigma	H4784
B27	Gibco/Termo Balıkçı	17504-44
Anti-mantar-antibiyotikler	Klon	SV30010
HBSS Kırmızı Ca2 +/Mg2 + içermez	Klon	SH30031.02
Hepes Belediyesi
Kültreks	Kültreks	3433-005-01	Bodrum Matris Özü (BME)
30 °C çalkalayıcı	NewBrunswick Bilimsel A.Ş.	Seri 25 İnkübatör Çalkalayıcı

Serisi Sertifikası