BC Hücrelerinin Birlikte Kültürlenmesi: Kanser Hücresi Proliferasyonunu İncelemek için Meme Kanseri Hücrelerinin Kemik Parçalarıyla Kültürlenmesi

Özet

Kaynak: Templeton, Z. S., et al. Metastatik Nişin Meme Kanseri Hücresi Kolonizasyonunu İncelemek için İnsan Femur Dokusu Eksplantlarını Kültür Yöntemleri. J. Vis. Deneyim (2015).

Bu videoda, bir insan kemik dokusu eksplant model sisteminde kanser hücresi proliferasyonunu ve kolonizasyonunu ölçmek için femur kemik eksplantlarına bitişik meme kanseri hücrelerinin kültürlenmesi açıklanmaktadır.

Protokol

1. BLI Kullanarak Meme Hücresi Proliferasyonunu Ölçmek için Kemik Parçalarına Bitişik Meme Kanseri Hücrelerinin Birlikte Kültürlenmesi

1. Deneyden önce, 2 x 10⁵ meme kanseri hücresi / 50 μl içeren bir süspansiyon hazırlayın ve kültürde kemik parçalarını hareketsiz hale getirmek için kemik mumu tıkaçları hazırlayın. Bir P200 mikropipet ucunu 3 parçaya kesin ve küçük (~ 35 mg) kemik mumu parçalarını kesmek için en büyük parçanın dar ucunu "çerez kesici" tarzında kullanın. Kemik balmumu tıkaçlarını saklamak üzere bir Petri kabına çıkarmak için en küçük parçanın geniş ucunu kullanın.
2. Her kuyucuğun saat 12 konumuna bir parça kemik mumu yerleştirin ve steril eldivenli bir işaret parmağıyla hafifçe bastırın.
3. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına DMEM-10%^FBS + Pen-Strep'te 1 x 10 5 meme kanseri hücresi içeren 50 μl hücre süspansiyonu pipetleyin. (Alternatif olarak, istenirse hücreleri dağınık bir düzende tohumlayın.) Hücre bağlanmasını desteklemek için plakayı 37 ° C'lik bir doku kültürü inkübatörüne 45 dakika boyunca yerleştirin.
4. Her deney kuyucuğu için 1 parça kemik balmumunun üzerine 1 kemik parçası yerleştirin ve sabitlemek için rongeur ile hafif bir baskı uygulayın. Belirli bir THR örneğinden 3 kemik parçası üstteki üç oyuğa yerleştirilecek, alttaki üç oyuk ise kontrol olarak sadece kemik mumu içerecek şekilde üç nüsha halinde deneyler yapın.
5. 5 ml'lik bir pipet kullanarak, meme hücrelerinin veya kemik parçalarının yerinden çıkmasını önlemek için her bir oyuğun yanına 5 ml DMEM-10% FBS'yi nazikçe ve yavaşça verin. Plakayı 20-24 saat boyunca 37 ° C'lik bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
6. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) yapmak için, plakayı inkübatörden çıkarın ve her bir oyuğa lusiferin substratı (300 μg / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek için) ekleyin. Aşağıdaki parametreleri kullanarak plakayı hemen bir IVIS Görüntüleme Platformunda görüntüleyin: 1 f-stop, küçük gruplama, 1 sn pozlama süresi, seviye D. Her bir kuyunun sinyal yoğunluğunu ve ortalama parlaklığı ölçün (fotonlar/saniye/santimetre kare/steradyan).
7. Tüm deney ve kontrol kuyuları için ortalama parlaklığı ölçmek üzere İlgi Alanlarını (ROI) tanımlamak için görüntüleme yazılımını kullanın. İstatistik yapmak ve grafikler oluşturmak için ortalama parlaklık değerlerini bir Excel sayfasına aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Yaşam Teknolojileri	10569-010	Tüm DMEM'i %10 fetal sığır serumu ve %1 Pen / Strep ile destekleyin
Fetal sığır serumu	Yaşam Teknolojileri	16000-044
Penisillen Streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-122
D-lusiferin ateşböceği, potasyum tuzu 5 g (30 mg / ml)	Yaşam Teknolojileri	L-8220
6 Kuyulu TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kümesi	Corning Anonim Şirketi	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Güzel Bilim Araçları	16021-14
Kemik balmumu	Cerrahi Uzmanlıklar Şirketi	903
IVIS 50 Görüntüleme Platformu	Kaliper Yaşam Bilimleri/PerkinElmer
MCF-7 meme kanseri hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-22
MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-26

Serisi Radarı Radarı