Organ Şartlandırılmış Ortam: Metastatik Kanser Çalışmaları için Hasat Edilen Organ Hücrelerinden Ortam Üretme

Özet

Kaynak: Piaseczny, M. M., et al. Organ Koşullu Ortamların Üretilmesi ve Meme Kanseri Metastatik Davranışı Üzerindeki Organa Özgü Etkilerin İncelenmesine İlişkin Uygulamalar. J. Vis. Exp.(2016).

Bu videoda, fare karaciğerinden türetilen organ koşullu bir besiyeri üretme yöntemi açıklanmaktadır. Bu model sistem, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların organ tropizmi ve kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek ve incelemek için kullanılabilir.

Protokol

1. Akciğer ve Beyin Şartlandırılmış Ortamların Üretilmesi

1. Steril bir doku kültürü başlığında, organlardan kalan kanı çıkarmak ve kan içeren PBS'yi aspire etmek için akciğer veya beyin içeren PBS tüplerini üç kez ters çevirin. Çözelti kan belirtisi olmadan berrak görünene kadar taze soğuk PBS ile tekrarlayın.
2. Akciğerleri ve beyinleri ayrı 60 mm2 cam petri kaplarına yerleştirin. İki steril neşter bıçağı kullanarak, doku parçaları yaklaşık ~ 1 mm3 boyutunda olana kadar tekrar tekrar ileri geri dilimleyerek akciğerleri veya beyinleri kıyın.
3. Hesaplanan ağırlık farkından doku parçalarını yeniden süspanse etmek için gereken ortam miktarını belirleyin.
   not: Akciğer ve beyin dokusu, 4:1 ortam:doku oranında (hacim/ağırlıkça) yeniden süspansiyon ile ağırlık normalize edilir.
4. Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unun (DMEM) uygun hacminde (daha önce adım 1.3'te belirlenen) doku parçalarını yeniden süspanse edin: 1x konsantre mitojen takviyesi ve penisilin (50 μg / ml) / streptomisin (50 μg / ml) ile takviye edilmiş F12 ortamı.
5. 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yeniden askıya alınmış akciğer veya beyin dokusu parçaları ekleyin.
6. Doku parçalarını ortamda 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her doku için şartlandırılmış besiyerini toplayın ve 50 ml'lik konik bir tüpe üç eşdeğer hacimde taze besiyeri ekleyerek daha da seyreltin.
7. Büyük doku kalıntılarını gidermek için her organ için 4 ° C'de 15 dakika boyunca seyreltilmiş şartlandırılmış ortamda 1.000 x g'da santrifüjleyin. Medya süpernatanı toplayın ve 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
8. Fareden fareye değişkenliği hesaba katmak için birden fazla fareden her organdan (yani, akciğerli akciğer ve beyinli beyin) havuz şartlandırılmış medya. Kullanıma kadar şartlandırılmış ortamları ayırın ve -80 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1x Fosfat tamponlu salin	ThermoFisher Bilimsel	10010-023	Steril tutun
60 mm2 cam petri kapları	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Steril tutun
DMEM: F12	Yaşam Teknolojileri	21331-020	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın, steril tutun
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122	Steril tutun
50 ml konik tüpler	Termo Bilimsel (Nunc)	339652	Steril tutun
0,22 μm şırınga filtreleri	Sigma-Aldrich	Z359904	Steril tutun
6 oyuklu doku kültürü plakaları	Termo Bilimsel (Nunc)	140675	Steril tutun
Neşter bıçakları	Balıkçı Bilimsel	S95937A	Steril tutun

Gazetesi Gazetesi