1. Doku Homojenatının Hazırlanması
- Diseksiyon rezeke edilen dokular (ameliyathaneden çıkarılan malign ve normal doku) hemen alınmak üzere eğitimli personel tarafından patoloji laboratuvarında bulunmaktadır. Tümör, NANT (tümörden mümkün olan en uzak mesafeden alınır) ve normal doku fragmanları, insan dokuları için standart biyogüvenlik prosedürleri kullanılarak bir BSL2 laboratuvarında cerrahi eksizyondan sonraki 1-3 saat içinde rutin olarak işlenir. Protokolün bir akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
- Tüm doku parçalarını (normal, NANT ve tümör) tartın ve uzunluk, genişlik ve yüksekliği (uzunluk x genişlik x yükseklik) ölçün. Bu, hücre alt popülasyonlarının, ekstrakte edilen RNA'nın vb. sonraki normalizasyonu için önemli bir adımdır.
not: Numune boyutu aralığı 100 ila 10.000mm3'tür ve mümkünse yağ içermez.
- Dokunun aslında tümörün bir parçası olduğunu doğrulamak için tümör parçasını H & E boyaması için bir cam slayt üzerine basın.
- Bunu, tümör parçasının üzerine bir cam mikroskop lamına basarak ve parmaklarınızla birkaç saniye boyunca hafif bir baskı uygulayarak yapın.
- Slaytı izopropanol ile 2 dakika sabitleyin ve ardından suda bir yıkama adımı uygulayın. Mayer'in hematoksilen ile dokuyu 30 saniye boyunca boyayın.
- Slaytı altı banyo su ile yıkayın. Floksin B'de 15 saniye boyunca% 2 boyayın.
- Bir banyo suda, ardından dört banyo izopropanol yıkayın ve bir banyo su ile bitirin.
- İzopropanol içinde 1 dakika inkübe edin ve süzün. İki ksilen banyosunda berrak.
- Ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edin. Tümör hücreselliğini inceleyin (Şekil 2).
not: Esas olarak, tümör hücreleri baskılı slayta yapışır - stromal, lenfoid veya adipoz hücreler nadiren kalır ve tümör hücreleri arasında boşluklar bırakır (Şekil 2).
- Doku parçasını, oda sıcaklığında 1 ml kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz hematopoietik hücre ortamı (bundan böyle ortam olarak anılacaktır) içeren küçük bir kültür kabına yerleştirin ve steril bir neşter kullanarak küçük parçalar halinde (~ 1 - 2 mm2) doğrayın.
- Her şeyi (doku parçaları + ortam) mekanik bir ayrıştırıcı C tüpüne aktarın.
- Petri kabını ve neşteri bir Pasteur pipeti kullanarak 2 ml besiyeri ile durulayın ve bunu C tüpüne ekleyin (ayrışma için besiyeri hacmi = 3 ml).
- Doku parçalarını tek bir hücre süspansiyonu halinde homojenize etmek için C tüpleri için mekanik ayrıştırıcı program A.01'i (en nazik program) kullanın. C tüpünü aparata yerleştirin ve programı arka arkaya iki kez çalıştırın (bir döngü = 25 saniye).
not: Bu homojenizasyon prosedürü insan meme dokusu için oluşturulmuş ve onaylanmıştır, diğer tümör veya doku tiplerinin farklı bir program kullanması gerekebilir ve önce test edilmelidir.
- C tüpünü aparattan çıkarın ve homojenatı doğrudan 50 ml'lik bir tüp üzerine oturmuş 40 μm'lik bir hücre süzgecine boşaltın. Adım 1.6'daki ile aynı Pasteur pipetini kullanarak, C tüpünde kalan sıvıyı hücre süzgecine aktarın.
- Filtrelenmiş sıvıyı 1 ml'lik bir mikropipet ucu kullanarak 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Hücre süzgecini ve 50 ml'lik tüpünü geçici olarak saklayın.
- C tüpünü ilave 3 ml besiyeri ile durulayın ve bunu, adım 1.6'daki ile aynı Pasteur pipetini kullanarak, 50 ml'lik tüp üzerinde hala oturan hücre süzgecine aktarın. Homojenize edilmemiş dokuda sıkışan artık sıvının maksimum bir miktarını 50 ml'lik tüpe, temiz bir Pasteur pipeti veya daha sonra eluatın kirlenmesini önlemek için atılan 1 ml uç ile süzgecin etrafında nazikçe hareket ettirerek sıkın.
- Hücre süzgecini orijinal C tüpüne baş aşağı yerleştirin ve homojenize edilmemiş doku tekrar C tüpüne düşecek şekilde 3 ml ortam ile durulayın.
- A.01 programının iki döngüsü için adım 1.7'deki gibi yeniden homojenize edin.
- Bu ikinci homojenatı 50 ml'lik tüp üzerine oturtulmuş hücre süzgecinden dökün, C tüpünü tekrar 3 ml'lik besiyeri ile durulayın (adım 1.10'daki gibi) ve Pasteur pipeti ile tekrar 50 ml'lik tüp üzerine oturan hücre süzgecine aktarın ve hücre süzgecinde sıkışan artık bağ dokusundan maksimum miktarda sıvı sıkın.
- Bu noktada, 15 ml'lik tüpte ~2.5 ml'lik bir hacim ve 50 ml'lik tüpte ~9 ml'lik bir hacim bulunmaktadır.
2. Doku Süpernatantı ve Hücrelerin Ayrılması
- Homojenatları 15 ml ve 50 ml'lik tüplerde oda sıcaklığında 600 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
- SN'yi 15 ml'lik tüpten temiz bir tüpe boşaltın ve geçici olarak 4 ° C'de saklayın. Bu süpernatan = birincil tümör, NANT veya normal doku SN (son hacim 2.5 ml) daha sonra arıtılır ve gelecekteki analizler için -80 ° C'de depolanmadan önce ayrılır (aşağıya bakınız).
- Süpernatanı 50 ml'lik tüpten atın.
- Her iki hücre peletini de 1 ml'lik son hacimde nazikçe yeniden süspanse edin. Kısaca, önce her iki tüpteki hücre peletini nazikçe kırın (tüpü sert bir yüzeye vurarak). Gevşek hücre peletini 50 ml'lik 500 μl ortamla yeniden süspanse edin ve ikinci peleti yeniden süspanse etmek için bu hücre süspansiyonunu 15 ml'lik tüpe aktarın. Hücrelerin maksimum geri kazanımı için bu adımı ikinci 500 μl ortamla bir kez tekrarlayın.
- 10 μl hücre süspansiyonunu küçük bir tüpe aktarın, 10 μl tripan mavisi (seyreltme 1: 1) ile karıştırın ve bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın.
not: Bu noktada, hücre süspansiyonunun bir kısmı, hücre boyutunu, tanecikliği ve istenirse, kapsamlı analiz veya deneyden önce homojenattaki nispi hücre dağılımının daha kesin bir şekilde değerlendirilmesi için sınırlı sayıda alt popülasyon belirtecini değerlendirmek için akış sitometrisi ile de analiz edilebilir. Akış sitometrisi ile yapılan tüm analizler, alt popülasyonların normalizasyonu için CD45 etiketlemesini içerir.
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Tümör, NANT veya normal dokudan gelen hücreler artık daha fazla saflaştırma veya analiz için hazırdır. Bu ek adımlar, ameliyatla aynı gün yapıldığında en iyisidir.
not: Akış sitometrik analizi için, ancak hücre sınıflandırması için, kalan kırmızı kan hücreleri, antikor etiketlemesinden sonra, hücre peletine 0.4 ml kırmızı kan hücresi lizis tamponu eklenerek, hemen 1 saniye girdaplanarak ve analizden önce oda sıcaklığında (ışıktan korunarak) en az 10 dakika inkübe edilerek parçalanmalıdır.
3. Doku süpernatantının açıklığa kavuşturulması
- 1.5 ml'lik tüpleri doku SN ile 15.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- Pelete dokunmadan veya rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın. İstenen alikotların sayısına ve hacmine bağlı olarak temiz bir tüpe (veya tüplere) aktarın.
- Süpernatanı ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
