1. %3 2-Hidroksietil Agarozun Hazırlanması
- Temiz, kuru 100 ml'lik bir cam şişeye 0.9 g 2-hidroksietil agaroz (Agarose VII) ve ardından 30 ml damıtılmış su ekleyin.
- Karışımı 15 saniye mikrodalgada pişirin ve hafifçe döndürün. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın.
- Solüsyon içeren şişeyi 15 dakika otoklavlayın.
- Daha fazla kullanmadan önce agaroz çözeltisinin RT'ye soğumasını bekleyin. Çözümü RT'de depolayın.
2. Alt Katmanın Hazırlanması: %0,6 Agaroz Jel
- 5 ml ve 10 ml'lik birkaç pipeti 37 °C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın, böylece agarozun kullanım sırasında pipette katılaşmasını önleyin.
- Şişe kapağını kısmen gevşetin ve önceden hazırlanmış %3 2-hidroksietil agaroz solüsyonunu 15 saniye mikrodalgada ısıtın. Ardından, çözeltiyi ve mikrodalgayı 15 saniye daha hafifçe döndürün
Dikkat: Agaroz çözeltisini döndürürken dikkatli olun çünkü çözelti havaya maruz kaldığında yükselir ve dökülebilir.
- Şişede artık katı jel varsa, birkaç saniye daha mikrodalgada pişirin.
- Agaroz solüsyonunun erken katılaşmasını önlemek için sonraki adımlarda agaroz solüsyonunu içeren şişeyi 45 °C'lik bir su banyosunda tutun.
- 37 °C su banyosunda sıcak MCF10DCIS ortamı.
not: MCF10DCIS besiyerleri DMEM/F12, %5 at serumu, %5 penisilin streptomisin'den oluşur.
- Önceden ısıtılmış pipetleri kullanarak 3 ml'lik %3'lük agaroz solüsyonunu 50 ml'lik steril bir konik tüpe aktarın.
- Hemen 12 ml ılık MCF10DCIS ortamı ekleyin ve agarozu ortamla karıştırmak için konik tüpü hafifçe ters çevirin. Daha sonra koloni sayımını engelleyeceği için herhangi bir baloncuk oluşturmamaya çalışın.
- Bu karışımdan 2 ml'yi, herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan 6 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna yavaşça ekleyin.
- Karışımın katılaşmasını sağlamak için 6 oyuklu kültür plakasını 4 ° C'de 1 saat boyunca düz bir yüzeyde yatay olarak inkübe edin.
- Karışım katılaştıktan sonra, plakayı 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Alt katman artık kullanıma hazırdır.
3. Hücre İçeren Tabakanın Hazırlanması: %0.3 Agaroz Jel
- MCF10DCIS hücreleri tripsinize edin ve bunları 4 x 104 / ml'lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltin.
- Önceden ısıtılmış pipetler kullanarak %3'lük agarozdan 2 ml alın ve 50 ml'lik steril bir konik tüpe aktarın.
- Konik tüpe hemen 8 ml MCF10DCIS ortamı ekleyin ve agarozu ortamla karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının.
- 2 ml MCF10DCIS hücresi (4 x 104 / ml) alın ve BB-CLA (0 μM (DMSO) veya 1 μM) ile tedavi edin.
- 1:1 oranında seyreltmede, hücreleri %0.6 agaroz ile karıştırın.
- 1 ml hücre-agaroz karışımını alın ve 6 oyuklu kültür plakasının (2 x 104 hücre / ml) alt tabakasına nazikçe ekleyin.
- Üst tabakanın katılaşmasını sağlamak için 6 oyuklu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca 4 °C'de düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin.
- Karışım katılaştıktan sonra, besleme katmanını eklemeden önce plakayı bir hafta boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre koyun.
4. Besleyici Katmanın Hazırlanması: %0.3 Agaroz Jel
- Önceden hazırlanmış %3'lük 2-Hidroksietil agaroz çözeltisini 15 saniye mikrodalgada ısıtın, çözeltiyi ve mikrodalgayı 15 saniye daha hafifçe döndürün.
- Agaroz çözelti şişesini 45 ° C'lik bir su banyosunda dengeleyin.
- MCF10DCIS ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
- 1 ml %3'lük agaroz solüsyonunu 9 ml ılık MCF10DCIS besiyeri ile 50 ml'lik konik bir tüpe karıştırın ve agarozu besiyeri ile karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
- Karışımı BB-CLA (0 μM (DMSO) veya 1 μM) ile muamele edin.
- Alt ve yumuşak katmanları içeren 6 oyuklu kültür plakasının her bir oyuğuna bu karışımdan 1 ml (kabarcık oluşturmadan) yavaşça ekleyin.
- Karışımın katılaşmasını sağlamak için 6 oyuklu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca 4 °C'de düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin.
- Besleyici tabakası katılaştıktan sonra, plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Koloni oluşumu gözlenene kadar hücreleri yeni besiyeri ile doldurmak için mevcut besleyici tabakanın üzerine 1 ml% 0.3 agaroz / ortam / tedavi solüsyonu yerleştirerek bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın.
not: Yumuşak ve besleyici katmanlardaki agar çok yumuşaktır ve bu nedenle, besleyici katmandan eklenen besinler, hücrelere ulaşmak için hücre içeren katmana kolayca yayılır.