Kuyruk Damarı Enjeksiyonu: Bir Fare Modelinde Metastatik Çalışmalar için Kanser Hücrelerini Uygulamak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Warren ve diğerleri, Akciğerlerdeki Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyonunu ve Yükünü Ölçmek İçin Kuyruk Veni Metastaz Testlerinin ve Gerçek Zamanlı İn Vivo Görüntülemenin Kombine Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, bir fare modeline kuyruk damarı enjeksiyonu kullanılarak etiketli kanser hücrelerinin enjekte edilmesi tekniği açıklanmaktadır. Gerçek zamanlı in vivo canlı hayvan görüntülemeyi kullanarak meme kanseri, metastaz oluşumunu ve büyümesini daha fazla izliyoruz.

Protokol

1. Etiketli kanser hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonu

NOT: Adım 1.2.4, sinjeneik BALB/c farelerinde büyüyen 4T1 hücreleri için optimize edilmiştir. Diğer kanser hücre dizileri ve fare suşları kullanılıyorsa, enjekte edilen hücre sayısı ve testin uzunluğu önce optimize edilmelidir.

1. Adım 2'de üretilen 4T1 hücre hatlarını, tam büyüme ortamında 15 cm'lik iki tabak üzerinde genişletin, böylece enjeksiyon gününde fazla hücreler mevcut olur.
2. Hücreleri kuyruk damarı enjeksiyonu için aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. Ortamı aspire edin ve hücre plakalarını 1x PBS ile durulayın.
   2. Hücreleri 15 cm'lik plaka başına 5 mL tripsin ile 2-5 dakika boyunca tripsin yapın (hücreler kuyu dibini serbestçe durulamalıdır). Tüm hücreleri konik bir tüpe aktarın. Doku kültürü kabından kalan hücreleri, tripsini söndürmek için yeterli tam büyüme ortamı ile yıkayın ve yıkamayı aynı konik tüpe ekleyin.
   3. Toplam hücre sayısını belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   4. Hücreleri 3 dakika boyunca 122 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri istenen konsantrasyonda 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Burada, her fareye 100 μL PBS'de 2,5 x 10⁴ hücre enjekte edilir, böylece hücreler 2,5 x 10⁵ hücre / mL'de yeniden askıya alınır. Hücre süspansiyonlarını enjeksiyona kadar buz üzerinde tutun.
      NOT: Hücrelerin tripsinizasyonu ile kuyruk veni enjeksiyonu arasındaki süreyi yaklaşık 1 saat ile sınırlamak önemlidir.
3. Adım 1.2.5'teki 4T1 hücrelerini lateral kuyruk damarı yoluyla farelere aşağıdaki gibi enjekte edin:
   1. Hayvan tesisindeki bir başlıkta çalışarak, tüpü ters çevirerek veya 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hücreleri nazikçe ama iyice karıştırın ve homojen bir şekilde yeniden süspanse edildiklerinden emin olun. Şırıngayı yüklemeden önce daima hücrelerin yeniden askıya alındığından emin olun.
   2. Hücre süspansiyonlu 1 mL'lik Luer kilitli bir şırınga yükleyin ve fazla hava kabarcıklarını dışarı atın. Eğim yukarı bakacak şekilde şırınganın üzerine 1/2 inç, 30 gauge bir iğne yerleştirin ve hava kabarcıklarını dışarı atın.
   3. Fareyi nazikçe bir kemirgen tutucuya yerleştirin.
   4. Yanal kuyruk damarları görünür ve genişlemiş olmalıdır. Değilse, kuyruğun tabanını hafifçe sıkıştırın ve damarları genişletmek için kuyruğu ılık musluk suyuna batırın.
      not: Damarların genişlemesi, fare kafesini bir ısıtma lambasının altına ve/veya bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirerek de sağlanabilir.
   5. Kuyruğu temizlemek için alkollü mendil kullanın. İğneyi konik tarafı yukarı bakacak şekilde kuyruk damarına sokun ve 100 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
      not: İğne damar içine düzgün bir şekilde yerleştirilirse, kolayca hafifçe ileri ve geri kaymalı ve piston itildiğinde direnç olmamalıdır. Başarılı enjeksiyonlar, enjeksiyonu takiben birkaç saniye boyunca damarın mavi renginin beyaza döndüğü bir "yıkama" ile de sonuçlanmalıdır.
4. İğneyi yavaşça çıkarın ve steril bir gazlı bez kullanarak, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine baskı uygulayın.
5. Fareyi kafesine geri koyun ve tam iyileşmeyi sağlamak için 15 dakika izleyin. Fareler haftada 3 kez ağrı veya sıkıntı belirtileri açısından kontrol edilmelidir.
6. Fareleri metastaz oluşumu ve büyümesi açısından 3-6 hafta boyunca izleyin (hücre hattı ve fare suşuna bağlı olarak) in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak (bkz. adım 1.5 ve 1.6).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 2.5 Tripsin	Gibco (Gibco)	15090-046	Doku kültürü için tripsin
Alkollü mendiller			Kuyruk damar enjeksiyonlarından önce enjeksiyon bölgesini sterolize etmek için
BALB/C fareleri (dişi, 6 hafta)	Taconic (özlü	BALB-F	Kuyruk veni metastatik kolonizasyonu ve yük tahlilleri için
Dulbecco&39; S Fosfat Tamponlu Tuzlu	Himedia (Merhaba)	TS1006
Edta	VWR (VWR)	97061-406	Doku kültürü için tripsini seyreltmek için kullanılır
FBS %100 ABD menşeili	VWR (VWR)	97068-085	Komple büyüme ortamının bileşeni
L-Glutamin	Gibco (Gibco)	25030-081	Komple büyüme ortamının bileşeni
Fare meme kanseri hücreleri, 4T1	Karmanos Kanser Enstitüsü	Aslakson, CJ ve diğerleri, 1992	Fare metastatik meme kafesi hücre hattı
Penisilin Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122	Komple büyüme ortamının bileşeni

Su Serisi