CTC İmmünofloresan Testi: Dolaşımdaki Tümör Hücrelerini Karakterize Etmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Garcia, J., et al. Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İmmünofloresan ile Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Sayımı.J. Vis. Uzm.(2019)

Bu videoda, küçük hücreli dışı akciğer kanseri hasta örneklerinde dolaşımdaki tümör hücreleri üzerindeki biyobelirteçleri karakterize etmek için bir teknik olan Dolaşımdaki Tümör Hücreleri (CTC) İmmünofloresan testi açıklanmaktadır. Bu test, kemoterapi, radyasyon ve olası immünoterapi tedavilerine yanıtı yansıtabilen tümör ve bağışıklık tepkisinin dinamik değişikliklerini izlemek için kullanılabilir.

Protokol

1. İmmünofloresan Boyama

1. Hemositometre tipi bir ızgara ile odacıklı bir slaytta mL başına hücre sayısını numaralandırın. Zenginleştirilmiş numuneyi% 0.2 bağlanma önleyici çözelti (Malzeme Tablosu) ile sitospin başına 100.000 hücre / 100 μL'ye ulaşan bir konsantrasyona seyreltin.
2. 50 μL% 0.2 bağlanma önleyici solüsyon ile pamuk (Malzeme Tablosu) kullanarak numune odasının konturunu nemlendirin. Numune haznesine bir polilisin cam sürgü yerleştirin ve kapatın.
3. 3 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek bir ucu %0,2 bağlanma önleyici solüsyonla kaplayın. Zenginleştirilmiş numuneyi yeniden süspanse edin ve hücre solüsyonunu numune haznesine aktarın. Özel bir santrifüj (Malzeme Tablosu) ile 400 rpm'de 4 dakika boyunca (ivme düşük) santrifüjleyin.
4. Biriktirme alanının etrafına bir silikon izolatör yerleştirin. Cam sürgüyü mikrobiyolojik güvenlik kabininin altında 2 dakika kurumaya bırakın.
5. 1 mL %16 paraformaldehiti (PFA) 3 mL steril PBS ile seyrelterek fiksasyon solüsyonunu hazırlayın. Numune başına 100 μL fiksasyon çözeltisi (% 4 PFA) ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin. Fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve 200 μL PBS ile üç yıkama yapın ve her biri 2 dakika
   RT'de inkübe edin DİKKAT: Solunmasını önlemek için kimyasal güvenlik kabini altında PFA kullanın.
6. Fetal sığır serumunu (FBS)% 5'te,% 5'te Fc reseptörü (FcR) bloke edici reaktifi ve% 1'de sığır serum albüminini (BSA) steril PBS'de (Malzeme Tablosu) seyrelterek doygunluk çözeltisini hazırlayın. Numune başına 100 μL doygunluk çözeltisi ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
7. Örnek başına 100 μL antikor çözeltisi ekleyin (CD45 antikoru 1/20; PanCK antikoru 1/500; PD-L1 antikoru 1/200; Qsp doygunluk çözeltisi 100 μL) (Malzeme Tablosu). Polilisin cam slaytı 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Emici bir kağıdı 2 mL steril su ile nemlendirin ve Petri kabını kapakla kapatın. Gece boyunca 4 °C'ye koyun ve ışıktan koruyun.
8. Antikor karışımını çıkarın ve 200 μL PBS ile 3 yıkama yapın ve her yıkamayı 2 dakika inkübe edin. Numuneyi 5 dakika kurumaya bırakın ve ışıktan koruyun. Biriktirme alanına 10 μL montaj solüsyonu (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve kabarcık oluşturmadan bir mikroskop lamel ile örtün. Lameli oje ile kapatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plüronik F-68 %10	Gibco (Gibco)	24040-032	Bağlanma önleyici çözüm. Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
EZ Hücre Hunileri	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A78710003	Pamuklu numune odası. Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Shandon Cytopsin4 santrifüj	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A78300003	Özel santrifüj. Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Paraformaldehit %16	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11490570	Fiksasyon çözümü. Saklama koşulları: +4°C
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Ultra Saf Sınıf 1X - 1L	1. Temel Laboratuvar	BUF-2040-1X1L	Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
FcR engelleme Ajanı	Miltenyi Biyotec	130-059-901	Saklama koşulları: +4°C
PD-L1 monoklonal antikoru (klon 29E2A3) - Phycoerythrin	Biyo Efsane	BLE329706	Saklama koşulları: +4°C
PanCK monoklonal antikoru (klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	53-9003-80	Saklama koşulları: +4°C
CD45 monoklonal antikoru (klon HI30) Alexa Fluor 647	Biyo Efsane	BLE304020	Saklama koşulları: +4°C
Floromount	Sigma	F4680	Montaj çözümü. Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Petri Kabı	Dutscher	632180	Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Özyme	BE17-512F	Saklama koşulları: +4°C
Polilisin slaytları	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	J2800AMNZ	Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Silikon İzolatör	Grace Biyo-Laboratuvarları	664270	Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Steril Deiyonize Su – 100 mL	1. Temel Laboratuvar	CUS-4100-100ml	Saklama koşulları: Oda sıcaklığı
Fetal Baldır Serumu (FCS)	Gibco (Gibco)	10270-106	Saklama koşulları: +4°C

Serisi