Tüm Akciğer Agaroz Enflasyonu: Akciğerleri Ex vivo Canlı Görüntülemeye Hazırlama Yöntemi

Özet

Kaynak: Van den Bijgaart R.J.E. ve ark., Akciğer Metastazı ve Mikroçevresinin Ex vivo Canlı Görüntülemesi, J. Vis. Exp. (2016)

Bu videoda, şişirme için agaroz kullanarak kanser hücreleri ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için akciğerleri ex vivo canlı görüntüleme için hazırlama yöntemi açıklanmaktadır. Örnek protokolde, canlı hücresel etkileşimleri gözlemlemeden önce agaroz şişirme prosedürü açıklanmaktadır.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Ex vivo Canlı Görüntüleme için Akciğerlerin Hazırlanması

>NOT: Akciğerlerdeki bağışıklık hücrelerinin gereksiz zorluklarını önlemek için mümkün olduğunca steril ve dikkatli çalışmaya çalışın.

1. Fare intraperitonealine (ip), IACUC tarafından onaylanan hayvan protokolü tarafından izin verilen ölümcül bir anestezik doz aşımı enjekte edin, ör., 1 ml% 2.5 Avertin. Farenin nefes almayı bırakmasını ve zararlı uyaranlara tamamen yanıt vermemesini bekleyin (arka pençe çimdikleme).
   NOT: Akciğer hücresi canlılığını zararlı bir şekilde etkileyebileceğinden servikal çıkık ve karbondioksit ötenazisinden kaçınılmalıdır.
2. Fareyi bir diseksiyon tahtası üzerinde hareketsiz hale getirin ve fareyi% 70 etanol ile sterilize edin.
3. Önce deriden enine epigastrik bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın, ardından peritondan benzer bir kesi yapın. Diseksiyon tahtasını dikey pozisyonda tutun ve inen aortu kesin, böylece kan göğüs boşluğunda değil karın içinde toplanır.
4. Vakumu serbest bırakmak için diyaframda küçük bir açıklık açın. Diyaframı çıkarmak ve akciğerlere görsel erişim sağlamak için 10. ve 12. kaburgaları kesin.
5. Göğüs kafesi üzerindeki soluk borusuna kadar cildi kesmek için cerrahi makas kullanın, ancak göğüs kafesini sağlam bırakın. Cildi göğüs kafesinden ayırın. Trakeanın kendisine zarar vermemeye dikkat ederek, çevredeki bağ dokusunu çıkararak trakeayı açığa çıkarın (Şekil 1A).
6. Açıkta kalan trakeada kıkırdak halkalarına paralel olarak yaklaşık 1 mm çapında küçük bir açıklık açın, mümkün olduğunca gırtlağa yakın olun (Şekil 1B). Soluk borusunu tamamen kesmemeye dikkat edin.
7. 20 G'lik bir iğne alın ve iğneyi 4-5 mm'lik bir karşı kuvvet olmadan trakeaya nazikçe sokun (Şekil 1D). İğnenin ucu trakeadan görülebilmelidir (Şekil 1C). Trakeadaki iğneyi stabilize etmek için forseps kullanın. Alternatif olarak, iğneyi yerinde tutmak için trakeanın etrafına bir dikiş bağlanabilir.
   NOT: Çok derine yerleştirildiğinde, karina travmatize olabilir veya akciğerlerin sadece bir tarafı şişirilebilir.
8. Bir şırıngayı 400 μl 37 °C, %2 düşük erime sıcaklıklı agaroz (doğrudan sabit sıcaklıktaki bir banyodan alınır) ile doldurun. Diseksiyon tahtasının ayakta durduğundan emin olun ve ılık agarozu iğneden akciğerlere yavaşça aşılayın, akciğerleri şişirmek için ~ 400 μl kullanın.
   NOT: Göğüs kafesinin içinde şişen akciğerleri izleyin. Akciğeri yırtılacağı için aşırı şişirmeyin.
9. Akciğerler şişirildikten sonra, göğüs kafesinin ~ 2 / 3'ünü doldurun, şırıngayı çıkarın ve herhangi bir agarozun sızmasını önlemek için iğneyi trakeanın içinde tutun.
10. Akciğerlerin içindeki agarozun sertleşmesini ve katılaşmasını sağlamak için şişirilmiş akciğerlerin üzerine yaklaşık 50 ml 20 °C PBS dökün. İğneyi yavaşça çıkarın ve katılaşmamış agarozun sızmasını önlemek için trakeayı forseps ile kapatın.
11. Sternotomi yaparak akciğerleri açığa çıkarın ve ardından akciğerleri çıkarın. Akciğerlerin eksizyonu için, trakeayı tamamen keserken trakeaya tutunun. Trakeayı nazikçe yukarı çekin, bağ dokusunu ve yemek borusunu kesin ve akciğerleri fareden ayrılana kadar göğüs boşluğundan dışarı çekin (Şekil 1E).
12. Fazla kanı yıkamak için akciğerleri ılık RPMI-1640'a daldırın ve lobların ana gövde bronşlarını hilusta kesmek için makas ve forseps kullanarak lobları nazikçe ayırın (Şekil 1F).
13. Görüntüleme yüzeyini en üst düzeye çıkarmak için lobları düz yüzeyi aşağı bakacak şekilde 24 oyuklu bir görüntüleme plakasının kuyusuna yerleştirin (Şekil 1G). Lobların üzerine 100 μl 37 °C RPMI-1640 ekleyin. Yüzmesini önlemek için lobların üzerine birkaç adet 15 mm'lik dairesel mikroskop kapak lamı yerleştirin.
14. RPMI-1640 ortamının buharlaşmasını önlemek için ılık PBS'yi çevredeki kuyucuklara dökün. 24 oyuklu plakayı dengelenmiş iklim odasına yerleştirin ve akciğer loblarını hava ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de tutun. İklim odasını konfokal mikroskobun sahnesine yerleştirin.
    NOT: Diğer gaz karışımları (örneğin, hipoksi / düşük oksijen koşulları altında hücre davranışını incelemek için _N2'de% 5 O ₂,% 5 CO₂) de düşünülebilir.

Sonuçlar

Şekil 1. Canlı görüntüleme için akciğerlerin hazırlanması için protokol.(A) Farenin hazırlanmasından sonra trakeanın maruz kalması. (B) Kıkırdak halkalarına paralel olarak açıkta kalan trakeada yapılan küçük kesme. (C) 20 G iğne trakeaya 4-5 mm sokulur. (D) Akciğerlere 400 μl% 2 düşük erime sıcaklığında agaroz ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anestezi	Na	Na	IACUC tarafından onaylanmış, anestezi ve/veya ötenazi için kullanılan anestezi
PBS, USP steril	Amresco A.Ş	K813-500ML	I.v. enjeksiyon için ultra saf kalite
1 adet PBS	UCSF hücre kültürü tesisi	Na
Strafor platformu	Na	Na	Diseksiyon tahtası olarak kullanılacaktır
İnce makas keskin	Güzel Bilim Araçları	14060-11
20 G x 1 iğne, kısa eğim	Bd	305178
Forseps	Roboz Cerrahi Mağazası	RS-5135
İğnesiz 1 mL şırınga	Bd	309659
Düşük erime sıcaklığında agaroz	Fransa	50111	10 ml çözelti yapmak için, 0.2 g agaroz ağırlığında, 10 ml 1 x PBS'ye ekleyin ve çözünmesi için ısıtın. Agaroz oda sıcaklığında katılaşacaktır, bu nedenle şişirme için kullanılana kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda tutun.
RPMI-1640 fenol kırmızısı içermeyen orta	Yaşam Teknolojileri	11835-030
24 kuyulu Görüntüleme plakası	E&K bilimsel	EK-42892
Cam kapaklı kızaklar, 15 mm	Balıkçı Bilimsel	22-031-144
Dijital CO2 ve sıcaklık kontrolörü	Okolab Laboratuvarı	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
İklim odası	Okolab Laboratuvarı	Na	http://www.oko-lab.com
Hücre Gözlemcisi eğirme diski konfokal mikroskop	Zeiss	Na
hava	UCSF (Birleşik Devletler Bankası)	Na
oksijen	UCSF (Birleşik Devletler Bankası)	Na
karbondioksit	UCSF (Birleşik Devletler Bankası)	Na

. Serisi arası Serisi Serisi