1. TUM622 Hücrelerinin 2D Kültürlerde Geçirilmesi ve Kültürlenmesi
- 37 ° C'de TUM622 hücreleri için sıcak 3D kültür ortamı ve hücre ayrışma reaktifleri (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 2D şişelerde %80 birleşimde TUM622 hücrelerini geçin. Genellikle, bu geçtikten 1 hafta sonra ortaya çıkar.
- Eski ortamı bir T75 şişesinden atın ve 6 mL HEPES tamponu ile bir kez yıkayın. Doğrudan hücrelere pipetlemekten kaçının.
- HEPES tamponunu aspire edin. Hızlı bir durulama için 4 mL tripsin / EDTA (0.25 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve tripsin / EDTA'yı atın.
- 2 mL tripsin/EDTA ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Şişeleri inkübatörden çıkarın ve hava kabarcıkları oluşturmadan hücreleri gevşetmek için şişeleri hafifçe vurun ve şişeleri 5 dakika daha inkübatöre geri koyun.
not: Tripsine uzun süre maruz kalmak hücrelere geri dönüşü olmayan bir şekilde zarar verir ve fenotiplerini değiştirir, bu nedenle hücrelerin tripsine maruz kalma süresinin sınırlandırılması önerilir.
- Hücrelerin ışık mikroskobu altında (4x veya 10x) ayrıldığını ve ayrıştığını onaylayın. 4 mL nötralizasyon tamponu (TNS tamponu) (Malzeme Tablosundaki alt kültür reaktif bilgilerine bakınız) ve ardından 10 mL 3D kültür ortamı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 10 mL'lik bir pipet kullanarak hücreleri daha fazla ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayılarını sayın.
- 20 mL 3D kültür ortamında tohum 0.8 x 106 hücre / T75 şişesi (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Harcanan ortamın yarısını taze ortamla değiştirerek hücreleri her gün besleyin.
2. 3D Kültür için Hücre Dışı Matriste TUM622 Hücrelerinin Kaplanması
- Deneyden bir gün önce, bazal membran matrisi şişelerini gece boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabında çözdürün. Plastik pipetleri (2 mL) ve uçları gece boyunca -20 °C'de soğutun.
not: Tüm bazal membran matrisleri, TUM622 hücrelerinin 3D büyümesini desteklemek için aynı kapasiteye sahip değildir. Bu nedenle, sağlam asini oluşumunu destekleyenleri belirlemek için birden fazla bazal membran matrisi lotu elde etmek ve test etmek gerekir. Genellikle bu, matriste daha yüksek bir protein konsantrasyonu (16-18 mg / mL) gerektirir.
- Deney gününde, 37 ° C'lik bir su banyosunda ılık 3D kültür ortamı, HEPES tamponu, tripsin / EDTA ve tripsin nötralizasyon tamponu (TNS). Kültürü kurmadan hemen önce, çözülmüş bazal membran matrisini buzdolabından çıkarın ve şişeyi buzun üzerine koyun.
- Doku kültürü plakalarını buz üzerine yerleştirilmiş metal platformlu bir soğutucuda soğutun. Santrifüj tüplerini buz üzerinde metal bir soğutma rafına yerleştirin.
- Adım 1.7'den elde edilen TUM622 hücrelerini kullanarak, kaplama için gereken istenen hücre sayısını hesaplayın. Tipik olarak, 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 15.000-30.0000 hücreye ihtiyaç vardır. Daha düşük yoğunluk, görüntüleme ve niceleme için daha uygundur, RNA ekstraksiyonu veya western blotlama için hücre toplarken daha yüksek yoğunluk tercih edilir.
- Hücre süspansiyonunu soğutulmuş bir santrifüj tüpüne aktarın (her tüp üçlü kaplama için hücreler içerir) ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de asılı bir kova santrifüjünde 300 x g'da döndürün.
- Süpernatanı, filtrelenmemiş bir uca (20 μL) bağlı bir aspirasyon pipeti ile dikkatlice aspire edin ve tüpte yaklaşık 100 μL ortam bırakın (tüp üzerindeki işaretleri kılavuz olarak kullanın).
- Soğutma rafına geri koymadan önce peleti yerinden çıkarmak ve ayırmak için tüpün yan tarafına hafifçe vurun.
- 2 mL önceden soğutulmuş pipetleri kullanarak, şişeyi buzla temas halinde tutarken birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek matrisi nazikçe karıştırın. Bu prosedür sırasında matrise kabarcık girmemesi için eşit ve orta hızda pipetleyin.
- Matrisin uygun hacmini her bir santrifüj tüpüne aktarın. 24 oyuklu bir plakada üçlü katları kaplamak için, her tüpe 1.1 mL bazal membran matrisi ekleyin.
- Önceden soğutulmuş uçları kullanarak, düzgün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için matrisi her tüpte yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- 310 μL hücre/matris süspansiyonunu önceden soğutulmuş 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın. Pipet, plaka yüzeyine 90°'lik bir açıyla yerleştirilir ve süspansiyon kuyunun merkezine eklenir. Süspansiyon, plakayı eğmeye gerek kalmadan tüm kuyuyu yaymalı ve kaplamalıdır.
- Aşağı akış immünofloresan analizini kolaylaştırmak için, hücre / matris süspansiyonunu paralel olarak 2 oyuklu odacık kızaklarına yerleştirin. 100 μL hücre/matris süspansiyonunu 2 oyuklu odacıklı kızaklı bir kuyunun merkezine aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Bu, matrisin çok daha küçük hacimli kubbe benzeri bir yapı oluşturmasına izin verir.
- Plakayı ve hazneyi bir doku kültürü inkübatörüne geri koyun ve matrisin katılaşmasına izin vermek için 30 dakika inkübe edin. Tek hücrelerin matris içinde eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı/slaytı ışık mikroskobu altında inceleyin (4x veya 10x).
- Her bir oyuğa 1 mL önceden ısıtılmış 3D kültür tam ortamı ve hazne slaytının her bir oyuğuna 1.5 mL 3D kültür ortamı ekleyin, ardından bunları inkübatöre geri koyun.
