RNA Ekstraksiyon Testi: miRNA Transfekte Edilmiş Akciğer Kanseri Hücrelerinden RNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Hossian, A. K. M. N. et al., Hücre Döngüsünü ve Anjiyogenezi Düzenlemek için Kombinatoryal miRNA Tedavilerinin Analizi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, miRNA transfekte edilmiş akciğer kanseri hücrelerinden RNA ekstraksiyon protokolünü açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre döngüsünü ve anjiyogenezi durdurmada kombinatoryal bir miRNA tedavi aktivitesini tanımlamak için kullanılabilir.

Protokol

1. miR-143 ve miR-506 iletimi

>DİKKAT: Açıklanan deneyleri gerçekleştirirken lateks eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Gerektiğinde, biyogüvenlik kabinini, kabin fanı açıkken, hava yollarını tıkamadan veya laminer hava akışını bozmadan kullanın. Koruyucu cam pencereyi her zaman üretici tarafından açıklandığı gibi uygun yüksekliğe ayarlayın.

1. NSCLC A549 hücrelerini, bir doku kültürü başlığında% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (kültür ortamı) ile desteklenmiş DMEM / F12K ortamında bir T25 cm² şişe / 6/96 oyuklu plakada tohumlayın ve bir doku kültürü inkübatöründe% 5 CO₂ ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. miR-143 ve/veya miR-506 taklitlerini askıya alın veya siRNA'yı transfekte edici ajanla karıştırın (2.4 μg miR, 14 μL transfekte edici ajan ile karıştırıldı; bkz. Malzeme Tablosu) 500 μL transfeksiyon ortamında ve 1.5 mL serum ve antibiyotik içermeyen DMEM / F12K ortamında 100 nM'lik bir nihai miRNA konsantrasyonunda. miRNA miktarı, farklı hücreler ve konsantrasyonlar üzerinde optimizasyon gerektirebilir. Uygun yaklaşımlar, artan miRNA konsantrasyonlarına (yani 50-200 nM) sahip hücrelerin transfeksiyonunu ve ilgilenilen genlerin ekspresyon aşağı regülasyonunun değerlendirilmesini içerir.
3. Kültür ortamını şişeden/plakadan çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
4. MiRNA/karıştırma dönüştürücü ajan kompleksleri ekleyin ve 6 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin (şişe boyutu, eklenen inkübasyon hacmini tanımlar).
5. Ortamı 4 mL kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat ve/veya 48 saat inkübe edin.
6. Her T25 cm2 şişesine 1 mL tripsin-EDTA ekleyerek, 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe ederek ve hücreleri hasat etmek için 3 mL kültür ortamı ekleyerek transfekte edilmiş hücreleri tripsinizasyon yoluyla hasat edin. Her şişenin içeriğini ayrı, işaretli 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Bir doku kültürü davlumbazında çalışın.
7. 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı çıkarın.
   not: Tüpün çalkalanması hücre kaybına neden olabileceğinden, süpernatantın çıkarılması sırasında dikkatli
olunmalıdır.
8. 2 mL 1x PBS ekleyin ve 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
9. Ortam ve süpernatant izlerini kaldırmak için 7. ve 8. adımları bir kez tekrarlayın.
   not: Bu aşamada numune tüpleri -80 °C'de saklanabilir veya hemen kullanılabilir.

2. RNA ekstraksiyonu

1. Çalışma alanını %70 izopropil alkol ve RNAse dekontaminasyon solüsyonu püskürterek temizleyin.
2. RNA ekstraksiyonu, uygun bir RNA kiti kullanılarak yapılmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Tüpleri -80 °C'den çıkarın ve çözülmelerine izin verin. 300 μL lizis tamponu ekleyin ve hücre zarını kırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
4. Eşit hacimde %100 ultra saf etanol ekleyin.
5. İyice karıştırın ve ayırma sütununa yerleştirin.
6. 30 saniye boyunca 11 ila 16 x g arasında santrifüjleyin ve akışı çıkarın.
7. 400 μL yıkama tamponu ekleyin ve tamponu çıkarmak için santrifüjleyin.
8. Her numuneye 75 μL DNA sindirim tamponu ile 5 μL DNAse I ekleyin ve 15 dakika inkübe edin.
9. Numuneyi 400 μL RNA hazırlama tamponu ile yıkayın.
10. 2x'i RNA yıkama tamponu ile yıkayın.
11. Kolona nükleaz içermeyen su ekleyin, santrifüjleyin, ardından RNA'yı toplayın.
12. Toplam RNA konsantrasyonunu bir UV spektrofotometresi ile ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A549 Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC CCL-185
Ambion Susturucu Negatif Kontrol No. 1 siRNA	Ambion Teknolojisi	AM4611
has-miR-143-3p miRNA Taklidi	Akbulut	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Taklidi	Akbulut	MCH02824
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Balıkçı Bilimsel	10438026
HyClone Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Balıkçı Bilimsel	SH30256FS
DMEM 4.5 g/L Glikoz, Sodyum Pirüvatsız, L-Glutamin ile	VWR (VWR)	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNase/ RNaz İçermeyen Damıtılmış Su	Canlandırıcı	10-977-015
Hızlı RNA Kitleri	Zymo Araştırma	R1055
Etanol, Mutlak (200 Kanıt), Moleküler Biyoloji Derecesi,	Fisher BiyoReaktifleri	BP2818500
-80 °C Dondurucu	VWR (VWR)	VWR40086A
Nano damla	Termo Bilimsel	NanoDrop bir C
96 kuyulu plaka	CELLTREAT Bilimsel	50-607-511
Penisilin-streptomisin 10/10	Antlanta Biyolojisi	B21210
CO2 İnkübatörü	Termo Bilimsel	HERAcell 150i
dnase (dnasse)	Zymo Araştırma	E1010
L-glutamin içeren F-12K Besin Karışımı (Kaighn's Mod.), Corning	Corning	45000-354
Fetal Sığır Serumu - Premium	Antlanta Biyolojisi	S11150 Serisi
Sıcaklık kontrollü santrifüj kibrit	Termo Bilimsel	ST16R Serisi
Sıcaklık kontrollü mikro santrifüj matchine	Eppendrof Balığı	5415R

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi arası Serisi