1. miR-143 ve miR-506 iletimi
>DİKKAT: Açıklanan deneyleri gerçekleştirirken lateks eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Gerektiğinde, biyogüvenlik kabinini, kabin fanı açıkken, hava yollarını tıkamadan veya laminer hava akışını bozmadan kullanın. Koruyucu cam pencereyi her zaman üretici tarafından açıklandığı gibi uygun yüksekliğe ayarlayın.
- NSCLC A549 hücrelerini, bir doku kültürü başlığında% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (kültür ortamı) ile desteklenmiş DMEM / F12K ortamında bir T25 cm2 şişe / 6/96 oyuklu plakada tohumlayın ve bir doku kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- miR-143 ve/veya miR-506 taklitlerini askıya alın veya siRNA'yı transfekte edici ajanla karıştırın (2.4 μg miR, 14 μL transfekte edici ajan ile karıştırıldı; bkz. Malzeme Tablosu) 500 μL transfeksiyon ortamında ve 1.5 mL serum ve antibiyotik içermeyen DMEM / F12K ortamında 100 nM'lik bir nihai miRNA konsantrasyonunda. miRNA miktarı, farklı hücreler ve konsantrasyonlar üzerinde optimizasyon gerektirebilir. Uygun yaklaşımlar, artan miRNA konsantrasyonlarına (yani 50-200 nM) sahip hücrelerin transfeksiyonunu ve ilgilenilen genlerin ekspresyon aşağı regülasyonunun değerlendirilmesini içerir.
- Kültür ortamını şişeden/plakadan çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- MiRNA/karıştırma dönüştürücü ajan kompleksleri ekleyin ve 6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin (şişe boyutu, eklenen inkübasyon hacmini tanımlar).
- Ortamı 4 mL kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat ve/veya 48 saat inkübe edin.
- Her T25 cm2 şişesine 1 mL tripsin-EDTA ekleyerek, 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe ederek ve hücreleri hasat etmek için 3 mL kültür ortamı ekleyerek transfekte edilmiş hücreleri tripsinizasyon yoluyla hasat edin. Her şişenin içeriğini ayrı, işaretli 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Bir doku kültürü davlumbazında çalışın.
- 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı çıkarın.
not: Tüpün çalkalanması hücre kaybına neden olabileceğinden, süpernatantın çıkarılması sırasında dikkatli olunmalıdır.
- 2 mL 1x PBS ekleyin ve 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Ortam ve süpernatant izlerini kaldırmak için 7. ve 8. adımları bir kez tekrarlayın.
not: Bu aşamada numune tüpleri -80 °C'de saklanabilir veya hemen kullanılabilir.
2. RNA ekstraksiyonu
- Çalışma alanını %70 izopropil alkol ve RNAse dekontaminasyon solüsyonu püskürterek temizleyin.
- RNA ekstraksiyonu, uygun bir RNA kiti kullanılarak yapılmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Tüpleri -80 °C'den çıkarın ve çözülmelerine izin verin. 300 μL lizis tamponu ekleyin ve hücre zarını kırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Eşit hacimde %100 ultra saf etanol ekleyin.
- İyice karıştırın ve ayırma sütununa yerleştirin.
- 30 saniye boyunca 11 ila 16 x g arasında santrifüjleyin ve akışı çıkarın.
- 400 μL yıkama tamponu ekleyin ve tamponu çıkarmak için santrifüjleyin.
- Her numuneye 75 μL DNA sindirim tamponu ile 5 μL DNAse I ekleyin ve 15 dakika inkübe edin.
- Numuneyi 400 μL RNA hazırlama tamponu ile yıkayın.
- 2x'i RNA yıkama tamponu ile yıkayın.
- Kolona nükleaz içermeyen su ekleyin, santrifüjleyin, ardından RNA'yı toplayın.
- Toplam RNA konsantrasyonunu bir UV spektrofotometresi ile ölçün.