1. miR-143 ve miR-506 iletimi
>DİKKAT: Açıklanan deneyleri gerçekleştirirken lateks eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Gerektiğinde, biyogüvenlik kabinini, kabin fanı açıkken, hava yollarını tıkamadan veya laminer hava akışını bozmadan kullanın. Koruyucu cam pencereyi her zaman üretici tarafından açıklandığı gibi uygun yüksekliğe ayarlayın.
- NSCLC A549 hücrelerini, bir doku kültürü başlığında% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (kültür ortamı) ile desteklenmiş DMEM / F12K ortamında bir T25 cm2 şişe / 6/96 oyuklu plakada tohumlayın ve bir doku kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- miR-143 ve/veya miR-506 taklitlerini askıya alın veya siRNA'yı transfekte edici ajanla karıştırın (2.4 μg miR, 14 μL transfekte edici ajan ile karıştırıldı; bkz. Malzeme Tablosu) 500 μL transfeksiyon ortamında ve 1.5 mL serum ve antibiyotik içermeyen DMEM / F12K ortamında 100 nM'lik bir nihai miRNA konsantrasyonunda. miRNA miktarı, farklı hücreler ve konsantrasyonlar üzerinde optimizasyon gerektirebilir. Uygun yaklaşımlar, artan miRNA konsantrasyonlarına (yani 50-200 nM) sahip hücrelerin transfeksiyonunu ve ilgilenilen genlerin ekspresyon aşağı regülasyonunun değerlendirilmesini içerir.
- Kültür ortamını şişeden/plakadan çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- MiRNA/karıştırma dönüştürücü ajan kompleksleri ekleyin ve 6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin (şişe boyutu, eklenen inkübasyon hacmini tanımlar).
- Ortamı 4 mL kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat ve/veya 48 saat inkübe edin.
- Her T25 cm2 şişesine 1 mL tripsin-EDTA ekleyerek, 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe ederek ve hücreleri hasat etmek için 3 mL kültür ortamı ekleyerek transfekte edilmiş hücreleri tripsinizasyon yoluyla hasat edin. Her şişenin içeriğini ayrı, işaretli 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Bir doku kültürü davlumbazında çalışın.
- 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı çıkarın.
not: Tüpün çalkalanması hücre kaybına neden olabileceğinden, süpernatantın çıkarılması sırasında dikkatli olunmalıdır.
- 2 mL 1x PBS ekleyin ve 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Ortam ve süpernatant izlerini kaldırmak için 7. ve 8. adımları bir kez tekrarlayın.
NOT: Bu aşamada numune tüpleri -80 °C'de saklanabilir veya hemen kullanılabilir.
2. Hücre döngüsü analizi
- Her numune için 5 x 105 hücreyi T25cm2'lik bir şişeye tohumlayın ve bölüm 1, adım 1-5'te açıklanan protokole göre bir transfeksiyon gerçekleştirin.
- 24 saat ve 48 saat sonra, hücreleri tripsinizasyon ile hasat edin.
- Hücre süspansiyonlarını 15 mL steril tüplere aktarın ve uygun şekilde etiketleyin.
- Numuneleri 5 dakika boyunca 751 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- 2 mL buz gibi soğuk 1x PBS, vorteks ekleyin ve 5 dakika boyunca 751 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Kalan ortamı çıkarmak için yıkama adımını 1x PBS ile tekrarlayın.
- Pipetleme ile 200 μL buz gibi 1x PBS ekleyerek peleti yeniden askıya alın ve kırın.
- Hafifçe girdaplama yaparken tüpe damla damla 2 mL %70 buz gibi soğuk etanol ekleyerek hücreleri sabitleyin.
- Tüpleri RT'de 30 dakika inkübe edin ve tüpleri 1 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin.
- Tüpleri 4 °C'den çıkarın ve 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- 2 mL buz gibi soğuk 1x PBS, vorteks ekleyin ve 5 dakika boyunca 751 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Promidyum iyodür (50 μg/mL) ve ribonükleaz A (200 μg/mL) ile 500 μL 1x PBS ekleyin.
- Numuneleri ışıktan korurken RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Akış sitometresi hakkında veri edinin. FSC ve SSC yoğunluk grafiğinin sol alt köşesindeki döküntüler ve FSC ile SSC yoğunluk grafiğinin sağ üst tarafındaki hücre kümeleri hariç olmak üzere, ana hücre popülasyonunu seçmek için ileri ve yan saçılmayı (FSC ve SSC) kullanın.
- Uygun yazılımla hücre döngüsü aşaması başına hücre popülasyonlarının tanımlanması için verileri analiz edin.