$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. miR-143 ve miR-506 iletimi
>DİKKAT: Açıklanan deneyleri gerçekleştirirken lateks eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Gerektiğinde, biyogüvenlik kabinini, kabin fanı açıkken, hava yollarını tıkamadan veya laminer hava akışını bozmadan kullanın. Koruyucu cam pencereyi her zaman üretici tarafından açıklandığı gibi uygun yüksekliğe ayarlayın.
- NSCLC A549 hücrelerini, bir doku kültürü başlığında% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (kültür ortamı) ile desteklenmiş DMEM / F12K ortamında bir T25 cm2 şişe / 6/96 oyuklu plakada tohumlayın ve bir doku kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- miR-143 ve/veya miR-506 taklitlerini askıya alın veya siRNA'yı transfekte edici ajanla karıştırın (2.4 μg miR, 14 μL transfekte edici ajan ile karıştırıldı; bkz. Malzeme Tablosu) 500 μL transfeksiyon ortamında ve 1.5 mL serum ve antibiyotik içermeyen DMEM / F12K ortamında 100 nM'lik bir nihai miRNA konsantrasyonunda. miRNA miktarı, farklı hücreler ve konsantrasyonlar üzerinde optimizasyon gerektirebilir. Uygun yaklaşımlar, artan miRNA konsantrasyonlarına (yani 50-200 nM) sahip hücrelerin transfeksiyonunu ve ilgilenilen genlerin ekspresyon aşağı regülasyonunun değerlendirilmesini içerir.
- Kültür ortamını şişeden/plakadan çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- MiRNA/karıştırma dönüştürücü ajan kompleksleri ekleyin ve 6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin (şişe boyutu, eklenen inkübasyon hacmini tanımlar).
- Ortamı 4 mL kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat ve/veya 48 saat inkübe edin.
2. Antikor hücre döngüsü mikrodizisi ile protein ekspresyonu
- T25 cm2 şişelerde her numune için 5 x 105 hücreli tohum ve bölüm 1, adım 1-5'te açıklanan protokole göre bir transfeksiyon gerçekleştirin.
- 24 saat ve 48 saat sonra, hücreleri tripsinizasyon ile hasat edin.
- Hücre süspansiyonlarını 15 mL'lik tüplere aktarın ve buna göre etiketleyin.
- 751 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- 2 mL buz gibi soğuk 1x PBS, girdap ekleyin ve 5 dakika boyunca 751 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Yıkama adımını 1x PBS ile tekrarlayın.
- Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 150 μL lizis tamponu ekleyin. Hücre zarlarını bozmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Herhangi bir lizis tamponu girişimini önlemek için, üreticinin solvent değişim sütunlarını kullanarak lizis tamponunu etiketleme tamponu ile değiştirmek için bir tampon değişimi gerçekleştirin.
- Bir BCA testi ile toplam proteini ölçün.
- 70 μg protein numunesi alın ve 75 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için etiketleme tamponu ekleyin.
- 1 mg biyotin reaktifine (biotin/DMF) 100 μL dimetilformamid (DMF) ekleyin.
- Her protein örneğine (biyotinile protein örneği) 3 μL biotin / DMF ekleyin ve RT'de 2 saat inkübe edin.
- 35 μL durdurma reaktifi ekleyin ve girdaplama ile karıştırın.
- Numuneleri RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Mikrodizi slaytlarını, kullanmadan önce 1 saat RT'ye ısınmaları için buzdolabından çıkarın.
- RT'de 45 dakika boyunca sürekli çalkalayarak bir Petri kabında% 3 kuru süt çözeltisi (üretici tarafından sağlanan bloke edici reaktifte) ile slaytları inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma için blokaj gerçekleştirin.
- Slaytları ddH2O su ile yıkayın (aksi belirtilmedikçe, yıkama ddH2O ile yapılır).
- Engelleme solüsyonunu slayt yüzeylerinden tamamen çıkarmak için yıkama adımını ~10x tekrarlayın. Bu, düzgün ve düşük bir arka plan elde etmek için önemlidir.
- Kaydırak yüzeylerindeki fazla suyu alın ve kaydırakların kurumasına izin vermeden bir sonraki adıma geçin.
- % 3 kuru sütü bir birleştirme reaktifi içinde çözerek birleştirme çözeltisi hazırlayın.
- 6 mL birleştirme çözeltisi ve adım 12'den önceden hazırlanmış biyotinile protein örneğinin tam miktarına ekleyin.
- Satıcı tarafından sağlanan bağlantı odasının bir kuyucuğuna bir slayt yerleştirin ve buna ~ 6 mL protein birleştirme karışımı ekleyin.
not: Slaytın protein birleştirme karışımı çözeltisine tamamen daldırıldığından emin olun.
- Birleştirme odasını kapatın ve bir orbital çalkalayıcıda sürekli çalkalama ile RT'de 2 saat inkübe edin.
- Slaytları bir Petri kabına aktarın ve 30 mL 1x yıkama tamponu ekleyin. Petri kabını orbital çalkalayıcıya yerleştirin, 10 dakika çalkalayın ve çözeltiyi atın.
- Adım 24 2x'i tekrarlayın.
- Slaytları ddH2O su ile adım 17 ve 18'de açıklandığı gibi yoğun bir şekilde durulayın ve kurumasını önlemek için hemen bir sonraki adıma geçin.
- 30 mL tespit tamponuna 30 μL Cy3-streptavidin (0.5 mg / mL) ekleyin.
- Slaytı bir Petri kabına yerleştirin ve Cy3-streptavidin içeren 30 mL algılama tamponu ekleyin.
- Işıktan korunarak sürekli çalkalayarak 20 dakika orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
not: Cy-3 floresan bir boyadır. Floresan yoğunluğunu korumak için alüminyum folyo ile örtün veya karanlık koşullarda çalıştırın.
- 24-26. adımları uygulayın ve hafif bir hava akımı kullanarak veya slaytı 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirerek sürgünün kurumasını bekleyin ve 1300 x g'da 5-10 dakika santrifüjleyin.
- Sürgüyü sürgü tutucuya yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplayın.
- Slaytı bir mikrodizi tarayıcıda uygun uyarma ve emisyon dalga boylarıyla tarayın. Cy3 durumunda, uyarma dalga boyu zirvesi ~ 550 nm'de ve emisyon zirvesi ~ 570 nm'dir.
- Verileri analiz edin (kullanılan yazılım için Malzeme Tablosuna bakın).