Flow Sitometrisi için Fare Akciğeri Hazırlığı: Flow Sitometrik Analiz için Akciğer Dokusundan Hücre Süspansiyonu Oluşturma

Özet

Kaynak: Moll, H. P., et al. PD-L1 Ekspresyonunu İncelemek İçin Sinjeneik Akciğer Adenokarsinom Hücrelerinin Ortotopik Transplantasyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, akciğer adenokarsinomu hücrelerinin PD-L1 ekspresyonunu incelemek için akış sitometrik analizi için fare akciğer hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Flow Sitometri için Akciğer Hazırlığı

1. İstenen deneysel son noktada, fareyi bir ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) karışımının deri altına enjeksiyonu ile sedasyon yapın ve servikal çıkık ile ötenazi yapın.
2. Karkası% 70 etanole batırın ve fareyi bant kullanarak bir diseksiyon tahtasına sabitleyin.
3. Ventral orta hat insizyonu yapın ve göğüs duvarı kaslarını ve karın organlarını ortaya çıkarmak için cildi nazikçe ters çevirin. Diyaframı delin ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları makasla kesin.
4. Kanın gitmesine izin vermek için sol ventrikülde küçük bir açıklık kestikten sonra 27 G'lik bir iğne kullanarak sağ ventrikülden 6 - 8 mL buz gibi PBS ile akciğerleri 3x perfüze edin. Akciğerler kandan arındırılmalı ve tamamen beyaza dönmelidir.
5. Akciğerleri çıkarın ve lobları makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrayın. Akciğer parçalarını 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1.5 mL akciğer sindirim tamponunda (RPMI,% 5 FCS, 150 U / mL kollajenaz I ve 50 U / mL DNaz I) inkübe edin.
6. Akciğer parçalarını 30 - 60 dakika arasında 37 ° C'de ve sürekli çalkalayarak inkübe edin.
7. Akciğer hücresi süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Süzgeci steril 10 mL'lik bir şırınganın arkasıyla temizleyin ve süzgeci %2 FCS ile 15 mL PBS ile durulayın.
8. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücreleri 1 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponunda yeniden süspanse edin ve artık eritrositlerin parçalanması için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
9. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri% 2 FCS ile 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi
   için istenen boyama protokolü ile devam edin not: Alternatif olarak, hücreler %30 FCS ve %10 DMSO içeren RPMI'de yeniden süspanse edilebilir ve daha sonraki analizler için bir dondurma kabı kullanılarak dondurulabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare akciğer adenokarsinomu hücre hattı			Kurum içinde izole
C57Bl/6 fare			İki arka planın çaprazının F1'i kullanılabilir (8-12 hafta)
129S fareler
RPMI 1640 Orta	Yaşam Teknolojileri	11544446
Fetal Baldır Serumu	Yaşam Teknolojileri	11573397
Penisilin / Streptomisin Çözeltisi	Yaşam Teknolojileri	11548876
L-Glutamin	Yaşam Teknolojileri	11539876
Ketasol (100 mg/mL Ketamin)	Ogris İlaç	8-00173
Ksilazol (20 mg/mL Ksilazin)	Ogris İlaç	8-00178
Künt forseps	Roboz Belediyesi	RS8260
Öğrenci İris Makası	Güzel Bilim Araçları	91460-11
DNaz I (RNaz İçermez)	New England Biyolojik Laboratuvarları	M0303S Serisi
Kollajenaz Tip I	Yaşam Teknolojileri	17100017
ACK Lizing Tamponu	Fransa	10-548E

Serisi