İmmünofloresan Testi: Tıbbi Bir Tel Üzerinde Yakalanan Tümör Hücrelerini Tanımlamak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Gallerani, G. et.al., Dolaşımdaki Tümör Hücrelerini Yakalamak için Tıbbi Bir Tel Kullanarak Tümör Hücrelerinin Karakterizasyonu: İmmünofloresan ve DNA FISH'e Dayalı Bir 3D Yaklaşım. J. Vis. Exp. (2017).

Bu videoda, işlevselleştirilmiş bir tıbbi tel üzerinde yakalanan dolaşımdaki tümör hücrelerinin immünofloresan boyama tekniği açıklanmaktadır. İşlevselleştirilmiş tel, CTC'lerin in vivo olarak doğrudan hastanın kan akışından izole edilmesine izin verir.

Protokol

1. Tel Üzerinde İmmüno-DNA BALIĞI

1. Kablolu hücre hattı spike-in (3D desteği)
   not: Ön kurulum, EpCAM pozitifliğine dayalı olarak yapışık hücre hatlarının doğru bir şekilde seçilmesini içerir. Tel, anti-EpCAM antikorları ile işlevselleştirilir, böylece sadece EpCAM pozitif hücreler boyanır.
   not: Herhangi bir hasarı önlemek için telin işlevsel kısmına dokunmayın.
   not: Tüm adımlar steril koşullarda laminer akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir.
   1. Bir T75 şişesinin tüm içeriğini (% 80 birleşme) 4 mL tam ortam kullanarak 5 mL'lik bir şişede yeniden süspanse edin; Tek bir spike-in için, hücrelerin tele yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için yaklaşık 2.000.000 hücre önerilir.
   2. Teli cam ambalajından çıkarın.
   3. Telin işlevselleştirilmiş altın kısmını şişeye batırın ve tel durdurucunun şişeye su geçirmez bir şekilde oturduğundan emin olun. Laboratuvar filmi ile kapatın.
      not: Tel durdurucu ile flakon arasında doğru bir eşleşme sağlamak için 5 mL'lik tüp kullanılması önerilir.
   4. RT'de bir tüp döndürücüde (0-120 açı) 30 dakika inkübe edin.
   5. 3 farklı temiz şişe kullanarak teli 1× PBS solüsyonunda üç kez durulayın.
2. Fiksasyon ve geçirgenlik<br /> Dikkat: Aseton, solunum yollarını tahriş edebilen yanıcı bir maddedir. Yalnızca asetona dayanıklı plastikler veya cam kaplar kullanın (PVC veya PVDF kullanmayın).
   not: Bu adımları kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
   1. Teli havayla kurutun.
   2. Teli RT'de 10 dakika boyunca aseton% 100 çözeltisine batırarak hücreleri sabitleyin. 5 mL'lik bir tüp kullanın.
      not: Tel durdurucu sabitleyici ile temas etmemelidir.
   3. Kabloyu RT.
      'da 5 dakika havayla kurutun not: Protokol buradan duraklatılabilir. Tel -20 °C'de saklanmalıdır. Teli uzun süreli saklama için paketlerken, kablo durdurucuyu işlevsel ucun yanına yerleştirin ve işlevselleştirilmiş uca zarar vermemeye dikkat ederek teli dikkatli bir şekilde saklama camı tüpüne yerleştirin. Saklama camını kapatın ve -20 °C'de (dikey veya yatay olarak) saklayın.
3. İmmünofloresan Gün 1
   not: Bu aşama bir gece inkübasyonu (~ 16 saat) içerir.
   1. 5 mL tüp kullanarak 1× PBS solüsyonunda iki kez yıkayın.
   2. Teli, 5 mL tüp kullanarak RT'de 30 dakika boyunca antikor seyreltme tamponunda inkübe edin.
   3. Veri sayfasında belirtildiği gibi, antikor seyreltme tamponunda florokrom ile konjuge edilmiş monoklonal birincil antikor seyreltmesi ile 150 μL antikor karışımı hazırlayın. Örneğin, EpCAM-FITC antikoru 1:20 seyreltme ile kullanıldı.
   4. İnkübasyon yapmak için aşağıdaki gibi bir p200 ucu kullanın: teli tel durdurucudan çıkarın ve teli ucun daha büyük deliğinden yavaşça sokun. Önce işlevselleştirilmemiş ucu yerleştirin ve altın parça daha büyük deliğin hemen ötesine gelene kadar teli daha küçük delikten yavaşça çekin.
   5. 150 μL antikor karışımını (örneğin, anti EpCAM_FITC antikoru 1:20 seyreltilmiş) yavaşça uca bırakın. Kabarcık oluşumu riskini önlemek için, işlevselleştirilmiş parça tamamen daldırılana kadar teli hafifçe döndürün.
   6. Ucun deliğini kapatın. Laboratuvar filmini deliğin etrafına sarmak yardımcı olabilir.
   7. Gece boyunca (~ 16 saat) karanlıkta 4 ° C'de dikey olarak inkübe edin.
4. İmmünofloresan 2. gün
   1. Teli 1× PBS'de iki kez yıkayarak antikor inkübasyonunu bloke edin.
   2. Kabloyu tel durdurucusuna yeniden takın.
      not: FISH testi yapılana kadar 5 mL'lik bir şişede 4 ° C'de 1X PBS'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
etanol	Carlo Erba	# 414605
Ara 20	BIYOGRAFI RAD	# 1706531
PBS (Fosfat Tamponlu Salin)	Medicago (Şifalı Bölge)	# 09-9400-100
aseton	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
KAUÇUK ÇİMENTO	Kraliyet Talens	# 95306500
EpCAM-FITC (klon: HEA-125)	Mitenyi	# 130-080-301
dev/dak 1640	Gibco (Gibco)	# 31870-025
XT ALK BA	MetaSystems Probları	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		İşlevselleştirilmiş tel
ZEISS Floresan Mikroskop Aksiyoskopu	Zeiss
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit yazılım	Nikon
Nikon DS-QiMc 12 bit dijital fotoğraf makinesi	Nikon	DS-QiMc

· ·