miRNA Ekstraksiyonu: Plazma Örneğinden miRNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Mensah, M. ve diğerleri, MicroRNA Tabanlı Sıvı Biyopsi: Akciğer Kanseri Taraması için Plazma miRNA İmza Sınıflandırıcısının (MSC) Deneyimi. J. Vis. Uzm. (2017).

MicroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunu düzenleyen dokuya özgü, küçük, kodlamayan RNA'lardır ve akciğer kanserinin erken teşhisi için ideal adayları temsil edebilir. Öne çıkan protokolde, erken akciğer kanseri taraması için hasta kan örneklerinden mikroRNA'yı izole edeceğiz.

Protokol

1. Plazma Örneği Toplama

1. Sprey kaplı K₂EDTA'lı Vacutainer tüplerinde 10 mL tam kan örneği toplayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   not: Hemolizi en aza indirmek için, plazmayı 2 saat içinde ayırın. Spesifik olmayan bir miRNA salınımına yol açan termal şok ve hücre lizizini önlemek için tam kanı düşük sıcaklıkta (yani 4 °C) saklamayın.
2. 1 saat içinde, plazmayı 1.258 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca ilk santrifüjleme adımıyla ayırın.
3. Plazma süpernatanı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve lenfositik halka ile temastan dikkatlice kaçının.
4. Plazmayı ikinci kez 1.258 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
5. 1 mL plazmayı 1.5 mL kriyoviyallere ayırın, plazma fraksiyonunun tüpün tabanında toplanmasını önleyin.
6. Hemolizin değerlendirilmesi için biri hariç tüm alikotları -80 ° C'de saklayın. Moleküler analiz 5 hafta içinde yapılmalıdır.

2. Plazma Toplam RNA Ekstraksiyonu

1. mL Homojenizasyon Çözeltisi başına 20 μL 1-Tiogliserol ile 1-Tiyogliserol / Homojenizasyon (OMG) çözeltisi hazırlayın. 1-Tiyogliserol viskoz olduğundan, doğru ölçüm için dikkatlice pipetleyin. OMG Çözeltisini kullanmadan önce buz üzerinde veya 2-10 °C'de soğutun.
   not: Çalışma solüsyonu 1 ay boyunca 2-10 ° C'de stabildir.
2. Şişeye 275 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek liyofilize DNaz I'i askıya alın ve hafifçe karıştırın (girdap yapmayın). Görsel bir yardım olarak, sulandırılmış DNaz I'e 5 μL mavi boya ekleyin ve çözeltiyi nükleaz içermeyen tüplerde tek kullanımlık alikotlara dağıtın. Sulandırılmış DNase I'i -30 °C ila -10 °C arasında saklayın.
3. 200 μL plazmadan başlayarak, 200 μL soğutulmuş OMG çözeltisi ekleyin.
4. Tam bir homojenizasyon sağlamak için 15-30 s vorteks. Köpürme meydana gelirse, numunenin buz üzerine yerleşmesine izin verin.
5. Homojenize numuneye 200 μL Lizis Tamponu ve 25 μL Proteinaz K ekleyin ve 20 saniye boyunca vorteksleyin.
6. Numuneleri 37 °C'de önceden ısıtılmış bir termomikserde 15 dakika inkübe edin.
7. Her biri için bir kartuş yükleyinampcihazın güverte tepsisine yerleştirin ve fişi uygun konuma yerleştirin.
8. Lizatı alet kartuşundaki uygun konuma aktarın.
9. Kartuştaki uygun konuma 5 μL DNaz I çözeltisi ekleyin.
10. Her bir elüsyon tüpünün tabanına 60 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
11. "RSC miRNA Doku" yöntemini seçin ve otomatik saflaştırma çalışmasına başlayın. Toplam RNA örnekleri -80 °C'de saklanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 adet PBS	Fransa	BE-17-516
20xTE Tampon, pH 8.0	Moleküler prob	T11493	Nükleaz içermeyen suda 20X nihai konsantrasyona sahip olmak için 0,1X stok çözeltisini seyreltin
Nükleaz içermeyen su
Maxwell RSC miRNA Doku Kiti	Promega	AS1460	Kit, Homojenizasyon Solüsyonu, DNaz I, Proteinaz K, Lizis Tamponu ve kartuşlar içerir. 1-Tiyogliserol için, solunması ve cilt ve gözlerle temasından kaçınılmalıdır. Çeker Ocakların altında kullanın.
Vacutainer Emniyet Kilidi Kan Alma Seti	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	367286-364815
Vorteks Karıştırıcı	Velp Scientifica	F202A0173
ThermoMixer T-çalkalayıcı	Euroclone (Avrupa Klonu	A00564	RNA ekstraksiyonuna başlamadan önce Thermo Mikseri 37 °C'ye getirin
Maxwell RSC Enstrümanı	Promega	AS4500
Kriyojenik şişeler 1.5 ml	Sigma-Aldrich	Z359033