İmmünohistokimyasal Boyama: İnce Doku Kesitlerinden Mekansal Bilgi Elde Etmeye Yönelik Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Baharom F. ve ark., İnsan Akciğer Dendritik Hücreleri: İmmünohistokimya ve Akış Sitometrisi Kullanılarak Endobronşiyal Biyopsilerde Mekansal Dağılım ve Fenotipik Tanımlama. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, endobronşiyal biyopsilerden dendritik hücreleri tanımlamak için immünohistokimyasal boyama tekniği açıklanmaktadır.

Protocol

1. GMA bölümleme.

1. Damıtılmış su ile% 0.05 amonyak çözeltisi hazırlayın. Cam bıçağı ve biyopsiyi mikrotomun içine yerleştirin. Bıçak tutucuyu ve biyopsi bloğunun açısını, bıçak bloğun yüzeyine düz bir şekilde dayanacak şekilde ayarlayarak biyopsi bloğunu bıçakla dikkatlice hizalayın.
2. Mikrotomu yavaş bir kesme hızında kullanarak 2 μm kalınlığında kesitler kesin ve bölümleri amonyaklı su üzerinde aktarmak ve yüzdürmek için forseps kullanın. Bölümleri 45-90 saniye boyunca yüzdürün, böylece bölümün nazikçe antijen alımına ve açılmasına izin verin.
3. Mikroskop lamı ile bölümleri alın. Toluidin mavisi ile hızlı bir şekilde boyayarak biyopsi histolojisini kontrol edin.
4. Slaytları 50 °C'ye ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde kurutun ve plastik bir Pasteur pipeti kullanarak bir bölüme 500 μl filtrelenmiş toluidin mavisi lekesi uygulayın. Lekenin kenarında yeşil bir halka oluşmaya başlayana kadar sıcak plaka üzerindeki bölümü ısıtın ve ardından suyla yıkayın.
5. Bir ışık mikroskobu kullanarak biyopsi histolojisini kontrol edin. İmmünohistokimya için kullanılan kesitler, mümkün olduğunca az bez ve az düz kas içeren, hasarsız lamina propria ve epitelin iyi alanlarını içermelidir.
6. İyi histolojiye sahip kesitleri kesin ve immünohistokimyasal boyama için poli L-lizin kaplı (PLL kaplı) mikroskop slaytları ile alın. Analiz için her biyopsiden en az iki bölüm kesin. Slaytları en az 1 saat kurutun. Kuruduktan sonra, bölümler kalay folyoya sarılabilir ve -20 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir veya hemen immün olarak boyanabilir.

2. GMA'ya Gömülü Endobronşiyal Biyopsilerin İmmünohistokimyasal Boyanması

NOT: Sodyum azid toksiktir. % 0.1 sodyum azid çözeltisini bir çeker ocak içinde ve asitlerden uzakta hazırlayın. Asitlerle temas zehirli gazı serbest bırakır.

1. Elmas uçlu bir kalem kullanarak bölümlerin etrafını çizin ve slaytları bir boyama rafına yerleştirin.
2. Bir Peroksidaz bloğu gerçekleştirin. % 0.1 sodyum azid çözeltisi içinde% 0.3 hidrojen peroksitten oluşan bir peroksidaz blok çözeltisi hazırlayın. Bölümlere 1 ml peroksidaz bloğu uygulayın ve 30 dakika inkübe edin.
3. 0.05 M Tris-tamponlu tuzlu su (TBS), pH 7.6'lık bir yıkama çözeltisi hazırlayın. Slaytları TBS'de 3x 5 dakika yıkayın.
4. DMEM'de% 1'lik bir BSA blok çözeltisi hazırlayın. Bunu önceden ve büyük hacimlerde yapın, alikot yapın ve ihtiyaç duyulana kadar dondurun. Slaytları boşaltın ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için bölümleri blok solüsyonunda 30 dakika inkübe edin. Spesifik olmayan bağlanma hala meydana gelirse, ikincil antikor ile aynı türden% 5 serum bloğu ile 30 dakikalık bir inkübasyon adımı ekleyin.
5. TBS'deki primer antikoru (CD45 veya CD1a) istenen konsantrasyona seyreltin (CD45 1: 1.000'de seyreltilir; CD1a 1:1,00 oranında seyreltilmiş) ve slaytlara uygulayın. Bölümleri örtün ve gece boyunca RT'de inkübe edin.
6. TBS'de slaytları üç kez yıkayın. TBS'de biyotinile edilmiş ikincil antikoru (birincil antikor konakçı türüne karşı yönlendirilmiş, bu durumda tavşan anti-fare F(ab'₂)) istenen konsantrasyona (1:300 seyreltme) seyreltin ve slaytlara uygulayın. RT'de 2 saat inkübe edin.
7. Kullanmadan en az 30 dakika önce bir streptavidin biotin-peroksidaz kompleksi hazırlayın. Tüm slaytları kaplayacak kadar olduğundan emin olun. Slaytları TBS'de üç kez yıkayın. Solüsyonu slaytlara uygulayın ve RT'de 2 saat inkübe edin.
8. Slaytları TBS'de üç kez yıkayın. 3-amino-9-etilkarbazol (AEC) peroksidaz substrat çözeltisi hazırlayın (üreticinin talimatlarına göre yapılır). Slaytlara uygulayın ve 20-30 dakika veya istenen leke yoğunluğu gelişene kadar inkübe edin.
9. Slaytları akan musluk suyunda 5 dakika durulayın. Bölümleri filtrelenmiş Mayer'in hematoksilen solüsyonu ile 2 dakika boyunca boyayın. Slaytları akan musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
10. Kızakları boşaltın ve bölümleri kalıcı sulu montaj ortamı ile kaplayın. Slaytları 80 °C'de bir kurutma fırınında kurutun. Slaytların soğumasını bekleyin ve ardından DPX ile monte edin ve bir lamel yerleştirin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMA bölümlendirme
Cam mikroskop slaytları	ThermoFisher Bilimsel	10143562CEF	Kesik kenarlar, buzlu uç
Poli-L-Lizin çözeltisi	Sigma-Aldrich	P8920-500 milyon	Çalışma çözümü için 1:10
Ultramikrotomi için düz cam şeritler	Alkar Belediyesi
Ara 20	Sigma-Aldrich	P2287 Serisi	Yıkama çözeltisi (% 0.1 Tween20)
LKB 7800B Bıçak Yapıcı	LKB (İngilizce
Kapsül ayırıcı	TAAB laboratuvarları	C065
Karbon çeliği tek kenar bıçakları	TAAB laboratuvarları	B054
Başkan yardımcısı
Amonyak, %25	VWR (VWR)	1133.1	1 L'de 2 ml, 1:500 (% 0.05)
Mikrotom	Leica Belediyesi		Leica RM 2165
ışık kaynağı	Leica Belediyesi		Leica CLS 150 XE
Salıncak kolu standlı mikroskop	Leica Belediyesi		Leica MZ6
GMA İmmünohistokimya
Elmas uçlu kalem	Histolab (Tarihsel Laboratuvar)	5218
Hidrojen peroksit% 30 çözelti	AnalaR Normapur	23619.264
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	S8032 Serisi
Tris	Roche	10708976001
Sodyum klorür	VWR kimyasalları	27810.295
Sığır serum albümini	Kırlangıç	82-045-2	Probumin BSA tanı sınıfı
Dulbecco'nun modifiye edilmiş kartalı orta (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-insan CD45 antikoru	Biyo Efsane	304002	Fare monoklonal, klon HI30, izotip IgG1k. 500 ng/ml çalışma konsantrasyonu
Anti-insan CD1a antikoru AbD	Serotech (Seroteknik	MCA80GA	Fare monoklonal, klon NA1/34-HLK, izotip IgG2a. 10 μg/ml çalışma konsantrasyonu
Fare monoklonal IgG1 izotipi kontrol	Abcam Belediyesi	ab27479
Fare monoklonal IgG2a izotipi kontrol	Dako Belediyesi	X094301-2
Vectastain ABC Elite standart kiti	Vektör Laboratuvarları	PK-6100
AEC (3-amino-9-etilkarbazol) Peroksidaz Substrat Uçurtma	Vektör Laboratuvarları	SK-4200
Mayers hematoksilen	HistoLab Laboratuvarı	1820
Kalıcı Sulu Montaj Orta	AbD Serotech	BUF058C
Kurutma fırını
DPX kalıcı montaj çözümü	VWR (VWR)	360292F
Işık mikroskobu	Leica Belediyesi		Leica DMLB ·
Mikroskop kamerası	Leica Belediyesi		Leica DFC 320
Analiz yazılımı	Leica Belediyesi		Leica Qwin V3