1. Eksozom İzolasyonu
Not: Eksozomların plazma örneklerinden izolasyonu, üreticinin protokolüne göre ve RNAse tedavisi eklenerek ticari bir kit ile gerçekleştirilmiştir: (tüm bu adımlar, kişisel ve çevre koruyucu ekipmanlarla ve biyolojik örneklerin manipülasyonu için özel yasal prosedür izlenerek gerçekleştirilmelidir).
- -80 °C'de saklanan her numuneden 1 ml plazma alın ve buzun üzerine koyun.
- Numuneyi RT'de 20 dakika boyunca 2.000 × g'da santrifüjleyin; hücreleri ve kalıntıları temizlemek için bu geçiş zorunludur.
- Temiz plazmayı içeren süpernatanı 1.5 ml'lik yeni bir tüpe aktarın.
- Yeni tüpü RT'de 20 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin.
- Temiz plazmayı içeren süpernatanı 1.5 ml'lik yeni bir tüpe aktarın.
- Süpernatana 100 ng/ml RNA ekleyin ve dolaşımdaki RNA'ları parçalamak için tüpü 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Tedavi edilen tüm plazmayı yeni bir 2 ml'lik tüpe aktarın ve 0.5 hacim 1x PBS ekleyin.
- Çözeltileri karıştırmak için numuneyi vorteksleyin.
- Numuneye 0.05 hacim Proteinaz K çözeltisi (kitin içine yerleştirilmiş) ekleyin.
- Numuneyi vorteksleyin ve ardından 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Numuneye 0.2 hacim eksozom çökeltme tamponu ekleyin ve çözeltileri ters çevirerek karıştırın.
- Numuneyi 2 °C ila 8 °C'de 30 dakika inkübe edin ve ardından numuneyi RT'de 5 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve atın. Pelet, izole edilmiş eksozomları içerir.
- Eksozomları yeniden süspanse etmek için seçilen tamponu eksozom peletine ekleyin. Tamponun seçimi, bu durumda planlanan aşağı akış analizine bağlıdır:
- TEM analizi yapmak için 100 μl 1x PBS ekleyin.
- RNA ekstraksiyonu için 346,5 μl spesifik lizis tamponu ekleyin (ticari kitten) (DİKKAT: kimyasal tehlike).
- Protein ekstraksiyonu için 100 μl lizis tamponu ekleyin (Tris-HCl 50 mM pH 7.6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 %0.5 - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprottinin 10 μg/ml) Western Blotting analizi yapmak için. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler).
- Yeniden askıya alınmış eksozomları -20 °C'de saklayın.
