3D DNA FISH: Bir Kromozom Üzerinde Belirli Bir Geni Bulmak İçin Bir Teknik

Bu makalede

Özet

Kaynak: Gallerani, G. et.al. Dolaşımdaki Tümör Hücrelerini Yakalamak için Tıbbi Bir Tel Kullanarak Tümör Hücrelerinin Karakterizasyonu: İmmünofloresan ve DNA FISH'e Dayalı 3D Bir Yaklaşım. (2017).

Kanser hastalarının kanından dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) izolasyonu ve karakterizasyonu, invaziv olmayan bir sıvı biyopsi türüdür ve nüks ve hastalığın ilerlemesi ile ilişkilidir. Bu video, ilgilenilen belirli bir geni incelemek için tıbbi bir tel üzerinde yakalanan CTC'ler üzerinde DNA floresan yerinde hibridizasyon (DNA FISH) tekniğini açıklamaktadır.

Protokol

>1. 3D DNA-BALIK Gün 2

>DİKKAT: Aletlerin ve nemli odanın yüksek sıcaklığına özellikle dikkat edilmelidir.

Hibridizasyon fırınını ve kuru ısı fırınını kurun (DNA-FISH protokolüne başlamadan ~ 3 saat önce). Hibridizasyon fırınını 75 °C'ye ayarlayın, kuru ısı fırınını 37 °C'ye ayarlayın ve 0,4× SSC çözeltisini (pH = 7,0 ± 0,1) 4 °C'ye soğutun.
not: FISH tamponlarının pH durumu kritiktir ve 7.0 ± 0.1 olmalıdır.
Teli buz gibi soğuk 0.4× SSC solüsyonunda 3 kez yıkayın.
not: Aşağıdaki prosedürler sırasında florokrom foto ağartmayı önlemek için teli karanlıkta tutun.
Çeker ocak altında karanlıkta 10 dakika kurutun.
Probu 5 saniye boyunca girdap haline getirin ve döndürün.
Probun 10 μL'sini cam mikrotüplere bırakın. Laboratuvar filmi ile örtün.
Mikrotüpleri aşağıdaki gibi döndürün: mikrotüpü kuru bir emiciye sarın, kağıdı 50 mL'lik bir tüpe koyun ve kısa bir süre döndürün.
Kurumuş teli dikkatlice mikrotüpe yerleştirin ve tel durdurucuyu yerleştirin. Kauçuk çimento ile kapatın.
Dikkat: Sonraki iki adım yüksek sıcaklıkları içerir. Koruyucu eldiven giyin.
Tam DNA denatürasyonu elde etmek için teli hibridizasyon fırınında 75 ° C'de 8 dakika boyunca koyu nemli bir odaya koyun.
Nemli odayı gece boyunca 37 °C'de kuru bir ısı fırınına taşıyın.

>2. 3D DNA-BALIK Gün 3

Bir su banyosuna ×0,4 SSC solüsyonu içeren bir slayt boyama kavanozu koyun ve 72 °C'ye ayarlayın.
0.4 × SSC çözelti sıcaklığını 72 ± 1 °C'ye ulaşana kadar kontrol edin.
Biri 2× SSC +% 0.05 Tween (pH = 7.0 ± 0.1) çözeltisi ve ikincisi damıtılmış su ile iki cam beher hazırlayın.
Nemli hazneyi kuru ısı fırınından çıkarın, lastik çimentoyu cımbız kullanarak tel durdurucudan dikkatlice çıkarın ve teli çıkarın.
not: İşlevselleştirilmiş uca zarar vermemeye dikkat ederek, telin kaplanmamış ucunu IN-Stopper'dan dikkatlice çekin.
Kabloyu 72 °C'de 2 dakika boyunca ×0,4 SSC çözeltisine batırın.
Teli RT'de 30 saniye boyunca 2× SSC +% 0.05 Tween solüsyonunda yıkayın.
Teli RT'de damıtılmış suda yıkayın.
Tel çeker ocak altında karanlıkta 10 dakika kurutun.
2 mL 1× PBS'de 1.43 μM'lik bir DAPI stok çözeltisi hazırlayın.
Telin işlevselleştirilmiş ucunu DAPI çözeltisi ile 2 mL'lik bir şişede RT'de karanlıkta 1 saat inkübe edin.
Kabloyu 1× PBS'de iki kez durulayın ve havayla kurutun.

>3. 3D mikroskop gözlemi ve analizi

Kabloyu tel tutucuya yerleştirin. İşlevselleştirilmiş ucu, uç bağlantı noktasıyla eşleşene kadar özel tutucunun giriş noktasından dikkatlice sokun. İşlevselleştirilmiş uca zarar vermemeye dikkat edin (Şekil 1a).
Özel tutucuyu mikroskop tablasına yerleştirin. 20 ×'lik bir lens kullanarak mikroskobun odağını ayarlayın. Önce kaba bir şekilde özel desteğe odaklanın ve ardından DAPI kanalında parlak görünen hücrelere ince bir şekilde ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: İşlevselleştirilmiş tel, ALK parçalama problarının şematik düzenlemesi, ALK yeniden düzenlemesinin beklenen modellerinin şeması ve özel tutucu.(a) Kırmızı kutular, telin üç ana parçasını vurgular: işlevselleştirilmiş uç, tel durdurucu ve işlevselleştirilmemiş uç. İşlevselleştirilmiş uç, telin en hassas kısmıdır ve hücre ayrılmasını veya hasar görmesini önleme...