$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Doku Dilimlerinin Fiksasyonu ve İşlenmesi
- Kültürlenmemiş 0 h referansını veya kültürlenmiş dilimi PBS'ye batırılmış bir filtre kağıdına dikkatlice kaldırın.
- Bunu yapmak için, 10 cm'lik bir plakaya yerleştirilmiş bir filtre kağıdının üzerine 2-3 mL PBS ekleyin. Dilimi filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve bir çift forseps kullanarak filtre kağıdını kaldırın.
- Filtre kağıdını bir histokasete aktarın ve sonraki işlem adımları sırasında dilimin konumunu gözle görülür şekilde işaretlemek için doku diliminin üzerine bir damla seyreltilmiş hematoksilen (deiyonize suda 1:1) ekleyin (Şekil 1D).
- Kaseti kapatın ve% 4 nötr tamponlu formalin çözeltisine aktarın. Dokuları gece boyunca 4 °C.
'de sabitleyin
not: Dilimi filtre kağıdının üzerine yerleştirirken, dilimin üst kısmının yukarı baktığından emin olun; Bu, adım 2.3'te açıklandığı gibi kesitleme ve analiz sırasında bir dilimin üst, orta ve alt bölümünü takip etmek için gereklidir.
- Ertesi gün, kasetleri %70 EtOH'ye aktarın ve hemen parafin gömülü doku işleme adımına geçin.
- Doku işlemeden önce, histokatetleri her biri 10 dakika boyunca %100 EtOH 2x'te yıkayın. Bu durumda, doku işleme için bir mikrodalga istasyonu kullanın. 1 mm doku kalınlığı için kullanılan programı seçin ve kılavuzda (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) verilen talimatları izleyin.
not: Diğer doku işleme makinelerini kullanırken, ince doku örnekleri için uygun programı kullanın.
- Parafin gömmek için bir histokaset açın ve dilimi filtre kağıdından dikkatlice kaldırmak için bir neşter kullanın. Filtre kağıdını atın ve dilimi sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.
- Eşit kesit sağlamak için dokuyu gömme kalıbının altına, örneğin düz bir ağırlıkla bastırın. Histocasette'in alt kısmını kalıbın üzerine yerleştirin, üzerine sıvı parafin ekleyin. Kalıbı soğuk bir ezme üzerinde 30 dakika soğumaya bırakın ve kalıbı parafin bloğundan ayırın.
not: Yatay gömmeye alternatif olarak, dilimi dik pozisyonda konumlandırarak tümör dilimini dikey olarak gömmek mümkündür. Dikey kesitler, tek bir kesit üzerinde canlılık veya fonksiyonel işaretleyici ifadesindeki gradyanların analizine kolayca izin verir. Yatay olarak gömülü dilimlerle gradyan analizi, adım 2.2'de açıklandığı gibi parafin kesitleme gerektirir.
2. Formalinle Sabitlenmiş ve Parafine Gömülü (FFPE) Dokuların İşlenmesi ve Analizi
- Bir mikrotom kullanarak FFPE doku dilim bloklarının 4 μm ince kesitlerini hazırlayın. Kesit alırken, bloğun açısını, bloğun yüzeyi bıçağa göre yatay olarak yönlendirilecek şekilde ayarlayın; Bu, doku boyunca eşit bölümler elde etmek için gereklidir.
- Potansiyel bir kültür kaynaklı canlılık gradyanının, dilimler boyunca hücre göçünün veya kültürlenmiş dilimler boyunca biyobelirteç ekspresyonundaki gradyanların yakalanmasını sağlamak için, aşağıda açıklandığı gibi nesne slaytları üzerindeki doku dilimlerinin her birinin üst, orta ve alt katmanlarından kesitler toplayın.
- Parafine gömülü doku diliminin sıralı doku kesitlerini önce cam slaytların üst kısmında toplayın. Daha derin doku katmanlarının bölümlerini ortaya doğru toplamaya devam edin, ardından cam slaytların alt kısmını takip edin (Şekil 1E).
not: Bir cam slayt üzerinde üç bölümü yerleştirmek için, gömülü doku dilimini çevreleyen fazla parafini kesin.
- Bölümlerin gece boyunca 37 °C'de kurumasına izin verin ve aşağıda açıklandığı gibi H & E boyama veya immünohistokimya ile devam edin.
not: FFPE bölümleri yüksek sıcaklıklarda veya uzun süre saklandığında antijenite kaybı meydana gelebilir. Parafin kesitlerinin 4 °C'de saklanması tavsiye edilir ve kesit alındıktan sonraki 6 ay içinde IHC analizleri yapılmalıdır.
- H & E boyama için, parafin bölümlerini aşağıdaki gibi deparafin ve rehidre edin: 5 dakika boyunca ksilen 3x, 1 dakika boyunca% 100 EtOH 3x, 1 dakika boyunca% 96 EtOH 2x,% 70 EtOH 1 x 1 dakika ve% 1 dakika boyunca deiyonize su 2x.
- Bölümleri taze filtrelenmiş hematoksilen çözeltisinde 10 dakika inkübe edin ve akan musluk suyu altında 5 dakika yıkayın. Bölümleri 2 kez asit alkole (% 70 EtOH içinde% 1 HCl) batırın ve 5 dakika akan musluk suyu altında yıkayın ve ardından 2 dakika% 0,5 eozin ile inkübe edin.
- Eozin adımını takiben, slaytları alkol ve ksilen çözeltilerine batırarak bölümleri aşağıdaki gibi kurutun: 15 saniye boyunca %96 EtOH 2x, 30 saniye boyunca %100 EtOH 3x, 1 dakika boyunca ksilen 3x. Son olarak, bölümleri ksilen bazlı bir montaj ortamına gömün.
