$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücrelerin ve Ortamın Hazırlanması
- 240 ml Iscove'un Modifiye Dubecco's Medium (IMDM) ve 50 ml fetal sığır serumu kullanarak ortamı hazırlayın. Fetal sığır serumunu sıcak su banyosunda çözdürmeyin, çünkü sıcaklıktaki hızlı artışlar serum stabilitesinde bir uzlaşmaya yol açabilir. 240 μl gentamisin 50 mg / ml ve 5 ml penisilin / streptomisin 100x'i standart bir kültür şişesinde birleştirin ve ortama ekleyin. Ortamı 4°C'de saklayın.
- Hazırlanan ortamı kullanarak 25cm2'lik bir şişede ~ 4 x 104 hücre / ml'de U937 hücrelerini tohumlayın. 15-20 μl hücre ve 15-20 μl tripan mavisini bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirerek ve içeriği karıştırarak bir TC20 hücre sayacı ve tripan mavisi dışlaması kullanarak hücreleri konsantrasyon ve canlılık açısından değerlendirin. Bu karışımın 15-20 μl'sini bir TC20 numune alma slaytına pipetleyin ve slaytı TC20 hücre sayacına yerleştirerek sayımları başlatın.
- Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin ve tripan mavisi dışlaması ve TC20 hücre sayacını kullanarak hücre canlılığını kontrol edin. Hücreler uygun bir konsantrasyonda olduğunda ve / veya uygun bir zaman dilimi için sonosensitizörlerle muamele edildiğinde, 3 ml hücreyi kültür şişesinden 20 ml'lik bir cam sintilasyon şişesine aktarın. Bu protokolde, U937 hücrelerini 48 saat boyunca büyütün ve daha sonra sonikasyondan önce hücrelerin kolesterolünü yeterince tüketmek için 30 dakika boyunca 0.5, 1 veya 5 mM MeβCD ile tedavi edin.
2. Hücre Sonikasyonu
- Deiyonize edilmiş, damıtılmış suyu bir vakum ve Buchner şişesi kullanarak degazdan arındırın. Suyu fincan kornasına aktarın ve kornanın üst kısmından 15 mm yukarıda bir seviyeye kadar doldurun. Sonikasyon işlemi, birkaç dakikalık bir süre boyunca suyun daha fazla gazdan arındırılmasına neden olur ve sistem numune sonikasyonundan önce çalıştırılmazsa, deney boyunca tutarsızlıklara yol açabilir. Bu nedenle, örnek sonikasyondan önce sistemi ~ 7 dakika çalıştırın.
- Hücreleri içeren sintilasyon şişesini tutma cihazına takın. Ardından, tutma cihazını fincan kornasının üst kısmına takın ve kornanın üst kısmından 15 mm yüksekliğe ayarlayın (kaydırma mekanizmasını kullanarak su yüzeyinde).
- Hücreler tipik olarak, bu darbelerin her biri arasında 1 saniye boşluk bırakılarak, üç adet 1 saniyelik ultrason darbesi kullanılarak sonikleştirilir. Bu protokol için, yukarıda belirtilen nabız dozlamasını kullanarak% 33 ve% 50 genlikte hücreleri sonikleştirin.
3. Sonikasyon Sonrası Hücrelerin Hasar Açısından Değerlendirilmesi
- Tripan mavisi ve TC20 hücre sayacını kullanarak asılı hücreleri hasar ve canlılık açısından değerlendirin. Ek olarak, bir Z2 sayacı kullanarak örneği analiz edin. Z2 sayaç analizi için, 100 μl'lik bir hücre süspansiyonunu 20 ml izotonik salin (200:1 oranında) içine pipetleyin. Analizden önce, Z2 partikül analizörünün açıklığını izotonik salin kullanarak en az iki kez yıkayın. Z2 örneğini sayaç tutucusuna yerleştirin ve sayımları başlatmadan önce platformu açıklığa kaldırın.
- Üretici tarafından sağlanan yazılımı kullanarak TC20 ve Z2 sayaçlarından veri alın. Bu verileri hücre hasarı, canlılık ve sonikasyondan hücresel kalıntı oluşumu için analiz edin.