XTT Testi: Hücre Canlılığını ve Mitokondriyal Aktiviteyi Değerlendirmek için Kolorimetrik Bir Test

Özet

Trendowski, M., et al. Tedavi Edilmemiş ve Tedavi Edilmiş Neoplastik Hücrelerin Sonik Duyarlılığını Belirlemek için Darbeli Düşük Frekanslı Ultrasonun Üretilmesi ve Kantitatif Analizi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu makale, hücre canlılığını ve mitokondriyal aktiviteyi değerlendirmek için kolorimetrik bir test olan XTT testi protokolünü açıklar.

Protokol

1. İşlem Görmüş U937 ve THP1 Hücrelerinin Hücre Canlılığını ve Mitokondriyal Aktivitesini Belirlemek için XTT Testi

1. XTT tahlillerinden önce, aynı koşullar altında U937 ve THP1 hücrelerini büyütün. Sonikasyondan önce 30 dakika boyunca aynı MeβCD konsantrasyon aralığına sahip hücreleri ön işlemden geçirin. XTT kitinin değerlendirmesi için bir dizi hasar geliştirmek için hücrelerin artık bir saniye aralıklarla 1-3 bir saniyelik darbeler kullanılarak sonikleştirilmesi dışında, daha önce olduğu gibi aynı ultrason parametrelerini kullanın.
   not: Bu adımların çoğu doğrudan XTT kit kılavuzundan alınmıştır ve yalnızca ilgili laboratuvarların rahatlığı için tekrarlanır.
2. Hücreleri 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Daha önce tarif edilen büyüme ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreleri ~ 1 x 10⁵ hücre / ml'de yeniden süspanse edin. U937 hücrelerini oyuk başına 100 μl'de üç kopya halinde düz tabanlı 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına tohumlayın ve ardından ayrı bir 96 oyuklu plaka kullanarak THP1 hücreleri için tekrarlayın. Boş absorbans okumaları olarak tek başına 100 μl tam büyüme ortamı içeren 3 kontrol kuyusunu dahil edin. Daha sonra aşılanmış plakaları 24 saat inkübe edin.
3. Kullanmadan önce XTT reaktifinin ve aktivasyon reaktifinin iki alikotunu 37 °C'de çözdürün. Berrak çözeltiler elde edilene kadar alikotları hafifçe döndürün. 5.0 ml XTT reaktifine 0.1 ml aktivasyon reaktifi ekleyin, bu da 96 oyuklu bir mikrotitre plaka testi için yeterli aktif XTT çözeltisi oluşturur. İşlemi diğer plaka için tekrarlayın.
4. Her kuyucuğa 50 μl aktif-XTT çözeltisi ekleyin. Plakayı 2 saat boyunca hücre kültürü CO₂ inkübatörüne geri koyun. Turuncu rengi pozitif kuyucuklara eşit olarak dağıtmak için inkübasyon süresinin ardından plakayı hafifçe çalkalayın. Bir mikrotitre plaka okuyucu kullanarak 450-500 nm dalga boyu arasında bir dalga boyunda hücreleri içeren tahlil kuyularının ve boş arka plan kontrol kuyularının absorpsiyonunu ölçün.
5. Boş kontrol kuyularını kullanarak mikrotitre plaka okuyucuyu sıfırlayın veya ortalama değerlerini belirli sonuçlardan çıkarın. Tüm tahlil kuyucuklarının absorbansını 630-690 nm arasındaki bir dalga boyunda tekrar ölçün ve elde edilen 450-500 nm değerlerinden değerleri çıkarın. Not: Bu ikinci absorbans tayini, tahlil sonuçlarından spesifik olmayan okumaların ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. XTT testi, her iki hücre hattı için dört kez tekrarlandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'su Medium NaHCO3 ve 25mM Hepes ile	Yaşam Teknolojileri	12440079
Branson SLPe 40kHz Hücre Bozucu ile 3" (25mm) Çanak Boynuz	Branson Ultrasonik	101-063-726	Sonication aygıt
Birinci Uç: 100 μl ve 1.000 μl Filtre Uçları	ABD Bilimsel	1120-1840, 1126-7810
100 μl Mikropipet	Wheaton	851164
1000 μl Mikropipet	Wheaton	851168
Forma Scientific Çift odacıklı su ceketli kuluçka makinesi	Forma Bilimsel	3131
XTT Hücre Proliferasyon Test Kiti	ATCC (Uzay Servisi)	30-1011K
96 Kuyulu Mikroplaka Okuyucu	Cole-Palmer ·	EW-13055-54
U937 İnsan Monositik Lösemi Hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL1593.2
THP1 İnsan Monositik Lösemi Hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	TİB-202