Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Abstract

Kaynak: Welschinger R. et al. Senkronizasyona Gerek Kalmadan Akış Sitometrisi Kullanarak Hücre Döngüsü İlerlemesinin Zamansal İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Video, hücre proliferasyonunu ölçmek için bromodeoksiüridin (BrdU) ile memeli hücrelerinin aşamalı darbe etiketleme testini açıklar. BrdU alımı, hücrelerin senkronize edilmesini gerektirmeden, belirli bir zamanda sentez aşamasında olan hücrelerin zamansal olarak izlenmesine izin verir.

Protocol

1. Çözeltiler ve Reaktifler

1. Tam RPMI
   1. 500 ml’lik bir RPMI-1640 ortamı şişesine 56 ml fetal buzağı serumu (FCS) ve 5.5 ml 200 mM L-glutamin ekleyin.
2. BrdU Stok Çözümü
   1. Dulbecco’nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 32.5 mM BrdU (10 mg / ml) hazırlayın.
3. BrdU Komple RPMI
   1. 10 ml Komple RPM’ye 6,2 μl BrdU stok çözeltisi ekleyin.
4. DNase Çözeltisi
   1. DPBS’de 1 mg DNaz / ml hazırlayın.
5. Boyama Tamponu
   1. DPBS’de %3 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS ve %0.09 sodyum azid hazırlayın.
6. Fiksasyon Tamponu, Geçirgenleştirme Tamponu ve Yıkama Tamponu tanımları için Malzeme Listesine bakın.

2. Hücreler

NOT: Hücreler 6 aydan daha uzun süre kültürlenmedi. Bu yöntem, hücre yoğunluğu ve kültür ortamında yapılan ayarlamalarla herhangi bir yapışmayan hücre hattına doğrudan uyarlanabilir. Deneyin başlangıcında katlanarak büyüyen hücreleri kullanın.

1. NALM6 hücrelerini Tam RPM’de T-75 kültür şişelerinde tutun. Tüm adımları Sınıf II Biyogüvenlik Kabini kullanarak steril koşullar altında gerçekleştirin.
2. Kültürü haftada üç kez bölerek NALM6 hücrelerini ml başına 1-2 x 10⁶ hücre arasında tutun.
3. Havada% 5 CO₂ içinde 37 ° C’de inkübe edin.

3. BrdU ile Hücrelerin Darbe Etiketlemesi

DİKKAT: Potansiyel bir mutajen ve teratojen olduğu için BrdU’yu dikkatli kullanın.

1. Hücreleri 5 dk.
   için 150 x g’da santrifüjleyin not: Hücrelerin taze ortama aktarılması, sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.
2. Bir hücre sayımı gerçekleştirin ve 2 x 10⁶ hücre / ml’de Tam RPM’de hücreleri yeniden askıya alın.
3. Hücreleri 1’de 2 BrdU Tam RPMI ile seyreltin ve 1 x 10⁶ hücre / ml’lik bir nihai hücre konsantrasyonu üretin.
4. 37 ° C’de% 5 CO₂ ile 45 dakika inkübe edin, ardından hücreleri 10’da 1 oranında tam RPMI ile seyreltin. Hücreleri 5 dakika boyunca 150 x g’da santrifüjleyin ve tüm süpernatanı dikkatlice atın.
5. Hücreleri küçük bir hacimde (~ 100 μl) tam RPMI içinde yeniden süspanse edin, bir hücre sayımı yapın ve 1 x 10⁶ hücre / ml’ye ayarlayın.
6. 1 ml hücreyi 48 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına pipetleyin. Daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için 1 ml DPBS’yi boş kuyucuklara pipetleyin.
7. İstenilen zaman noktaları için havada% 5 CO₂ içinde 37 ° C’de inkübe edin, burada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ve 24 saat
   not: Sürenin uzunluğu, deneysel tasarımın neyi ölçmeyi amaçladığına bağlı olacaktır.
8. Tüm hücreleri bir pipet kullanarak FACS tüplerine aktarın. İyiliği 1 ml hacim PBS ile sırayla 5 ml’lik bir toplam hacme kadar durulayın.
9. 5 dakika boyunca 150 x g’da santrifüjleyin ve tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücreler boyamaya hazırdır, bunu hemen yapın (bölüm 4).

4. Hücre Boyama

NOT: Hücrelerin yüzey boyaması gerekiyorsa, bunu fiksasyondan önce yapın ve hücrelerin baştan sona 4 °C’de tutulduğundan emin olun.

1. Hücreleri 100 μl boyama tamponunda yeniden süspanse edin (isteğe bağlı yüzey boyama için, yüzey antijenlerine önerilen antikor hacmini ekleyin ve 4 ° C’de 30 dakika inkübe edin).
2. 1 ml boyama tamponu ekleyin, 150 x g’da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   Not: Spesifik antikor, konsantrasyon, inkübasyon süresi vb. belirli deneysel hedeflere bağlı olarak değişecektir.

Materials

NALM6 	DSMZ 	ACC-128
5-Bromo-2′-deoxyuridine 	Sigma 	B5002-1G
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml 	Lonza 	12-167F
DPBS 	Lonza 	17-512F
Fetal Bovine Serum 	FisherBiotec 	FBS-7100113
CO2 incubator 	Binder	 C 150
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes 	BD Biosciences 	352008
BD LSR FORTESSA flow cytometer 	BD Biosciences 	FORTESSA
Centrifuge 	Spintron 	GT-175R