$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Çözeltiler ve Reaktifler
- Tam RPMI
- 500 ml'lik bir RPMI-1640 ortamı şişesine 56 ml fetal buzağı serumu (FCS) ve 5.5 ml 200 mM L-glutamin ekleyin.
- DNase Çözeltisi
- DPBS'de 1 mg DNaz / ml hazırlayın.
- Boyama Tamponu
- DPBS'de %3 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS ve %0.09 sodyum azid hazırlayın.
- Fiksasyon Tamponu, Geçirgenleştirme Tamponu ve Yıkama Tamponu tanımları için Malzeme Listesine bakın.
2. Hücre Boyama
NOT: Hücrelerin yüzey boyaması gerekiyorsa, bunu fiksasyondan önce yapın ve hücrelerin baştan sona 4 °C'de tutulduğundan emin olun.
- Hücreleri 100 μl boyama tamponunda yeniden süspanse edin (isteğe bağlı yüzey boyama için, yüzey antijenlerine önerilen antikor hacmini ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin).
- 1 ml boyama tamponu ekleyin, 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
not: Spesifik antikor, konsantrasyon, inkübasyon süresi vb. spesifik deneysel hedeflere bağlı olarak değişecektir.
- Fiksasyon ve Geçirgenlik
- Hücreleri 100 μl fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- 1 ml yıkama tamponu ekleyin, 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücreleri 100 μl geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- 1 ml yıkama tamponu ekleyin, 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücreleri tüp başına 100 μl fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 1 ml yıkama tamponu ekleyin, 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
NOT: Gerekirse protokol burada duraklatılabilir. Sabit hücreler, boyama tamponunda yeniden süspanse edilirse 4 ° C'de birkaç gün stabildir. Devam etmeden önce santrifüjlemeden sonra boyama tamponunu çıkarın.
- DNaz Tedavisi
- Hücreleri 100 μl DNaz çözeltisinde (30 μg DNaz / 106 hücre) yeniden süspanse edin ve hücreleri 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 1 ml yıkama tamponu ekleyin, 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Antikor Boyama
NOT: BrdU dışındaki hücre içi belirteçler için boyama, BrdU boyaması ile aynı anda gerçekleştirilebilir.
- ÖNEMLİ: Boyanmamış hücrelerden ve her bir florokrom ile etiketlenmiş hücrelerden oluşan kompanzasyon kontrolleri hazırlayın. İdeal olarak, kompanzasyon kontrolleri için deney tüplerinde kullanılanlarla aynı antikorları kullanın. Bununla birlikte, bu mümkün değilse, aynı florokromla konjuge edilmiş yüksek oranda eksprese edilen antijenlere karşı antikorları ikame edin.
- Hücreleri 50 μl yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve 1 μl/106 hücre BrdU antikoru ekleyin.
NOT: Diğer spesifik hücre içi antijenlere doğrudan konjuge antikorlar da eklenebilir.
not: Ser10 üzerinde fosforile edilen histon H3 antikorları, G2 ve M'deki hücreler arasında ayrım yapmak için kullanılabilir, histon H3, mitoz sırasında Ser10 üzerinde fosforile edilir. Tyr15 üzerinde fosforile edilen cdc2 antikorları, mitoza bağlı hücreleri tespit etmek için kullanılabilir.
- Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- 1 ml yıkama tamponu ekleyin, hücreleri 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre Döngüsü Analizi için DNA'yı Lekeleyin
- Peleti gevşetin ve 20 μl 7-AAD çözeltisi (0.25 μg) ekleyin.
NOT: Sabit miktarda 7-AAD/hücre kullanmak çok önemlidir.
- Hücreleri 1 ml Boyama tamponunda yeniden süspanse edin.