Lösemik Hücrelerin BMSC'lerle 2 Boyutlu Ko-kültürü: Lösemik Hücrelerin Alt Popülasyonlarını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Slone, W. L. et al. Kemoterapiye Dirençli Löseminin In Vitro Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, kemik iliği mikroçevresi ile etkileşimlerini incelemek için lösemi hücrelerinin kemik iliği stromal hücreleriyle uzun süreli 2D ko-kültür tekniği açıklanmaktadır. 2D kokültür modeli, akut lenfoblastik lösemi hücrelerini ve tümör hücresi fenotipini etkileyen kemik iliği stromal veya osteoblastlarını kullanır. Bu çalışma, kemoterapi maruziyeti sırasında lösemik hücrelerin kemik iliği destekli sağkalımının altında yatan mekanizmaların araştırılmasını destekleyecektir.

Protokol

1. İleri Düzey Hazırlık

1. Kemik iliği, stromal hücreler (BMSC) ve osteoblastların (OB) kültürlenmesi.
   1. Hem BMSC hem de OB'yi %6 CO_2'de 37 ° C'de tutun ve% 90 birleşmeye ulaşılana kadar 10 cm doku kültürü plakalarında büyütün.
   2. BMSC veya OB hücrelerini tripsinize edin ve 1: 2'yi yeni 10 cm'lik plakalara bölün. Hücreler, lösemik birlikte kültürleme için gerekli olana kadar bu standartlara göre büyütülür.

2. Ortak Kültürün Oluşturulması ve Sürdürülmesi

1. 10 ml tümör spesifik kültür ortamında 5-20 x^{10 6} lösemik hücreyi% 80 -% 90 birleşik BMSC veya OB plakasına ekleyin.
   NOT: Laboratuvarımız, %1 ila %7 arasında değiştiği gösterilen kemik iliği mikro ortamını daha iyi özetlemek için %5_O2'de 37 °C'de ko-kültürler bulundurmaktadır. Bununla birlikte, bu oksijen geriliminde ko-kültürlerin sürdürülmesi, üç lösemik alt popülasyonun kurulması için kritik değildir ve laboratuvarın takdirine bağlıdır.
2. Her 4 günde bir, 1 ml hariç tüm besiyerlerini (süspansiyondaki lösemik hücreler dahil) çıkarın ve 9 ml taze lösemik kültür besiyeri ile değiştirin. Plakadan 9 ml besiyerini çıkarırken, kemik iliği stromal hücrelerini (BMSC) veya osteoblast (OB) yapışık tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin.
   1. Plakayı yana eğerek ortamı çıkarın ve plakanın köşesindeki ortamı aspire edin. Ek olarak, taze ortam eklerken, BMSC veya OB yapışkan tabakasının minimum düzeyde bozulmasını sağlamak için plakanın köşesine yan duvara doğru damla damla eklediğinizden emin olun.
3. Ko-kültürün 12. gününden sonra, BMSC veya OB tabakasından lösemik hücreleri, kültür ortamını tabaktan yukarı ve aşağı doğru yaklaşık 5 ila 10 kez hafifçe pipetleyerek durulayın ve daha sonra 15 ml'lik konik tüpte toplayın. Adım 2.1.
   'de açıklandığı gibi yeni% 80 -% 90 birleşik BMSC veya OB plakasına yeniden tohumlayın NOT: Adım 2.3'te tarif edildiği gibi ko-kültürün nazikçe durulanması, BMSC veya OB tek tabakasını bozmadan askıda kalmış ve fazlı parlak lösemik hücreleri uzaklaştıracaktır. Bu, sadece tümör hücrelerinin bir sonraki ko-kültür plakasına aktarılmasına izin verir. Bu 12 günlük döngü, kullanıcı ihtiyaçlarına bağlı olarak gerektiği kadar tekrarlanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 x 20 mm Hücre Kültürü Kapları	Greiner Bio-Bir	664160
15 ml konik santrifüj tüpleri	Dünya Çapında Medikal Ürünler	41021037	Hücre toplama için kullanılır
Kültür Medyası
Osteoblast kültür ortamı	Promosyon Hücresi	C-27001	İnsan osteoblast ortamı için
RPMI 1640 ortamı	Medya Teknolojisi, Inc.	15-040	Tümör besiyeri hazırlığı için
Yapışık hücreler
İnsan Osteoblastları	Promosyon Hücresi	C-12720	İnsan osteoblastı, tedarikçinin tavsiyelerine göre kültürlendi.
İnsan Kemik Morrow Stromal Hücreleri	WVU Biyonumune Çekirdeği		Tanımlanmamış primer insan lösemisi ve kemik iliği stromal hücreleri (BMSC), Mary Babb Randolph Kanser Merkezi (MBRCC) Biyonumune İşleme Çekirdeği ve West Virginia Üniversitesi Patoloji Bölümü Doku Bankası tarafından sağlandı
Lösemik Hücreler
Reh	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC-CRL-8286	REH hücreleri, tedarikçinin tavsiyelerine ve önerilen besiyerine göre kültürlendi.
SD-1	DSMZ (Türkçe)	ACC 366	SD-1, tedarikçinin tavsiyelerine ve tavsiye edilen ortamlara göre kültürlendi.

Serisi Serisi Serisi Serisi Dersi