Lösemik Alt Popülasyon Hasadı: Lösemik Hücre Alt Popülasyonlarının 2D Ko-kültürden Mekansal Olarak Ayrılması İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Slone, W. L., et al. Kemoterapiye Dirençli Löseminin In Vitro Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, üç lösemik hücre alt popülasyonunun uzamsal olarak ayrılması için bir yöntem açıklanmaktadır: ortamda serbestçe yüzen asılı lösemik hücreler, mezenkimal stromal hücre tek tabakasının yüzeyine yapışan faz parlak lösemik hücreler ve 2D ko-kültürden mezenkimal stromal hücre tek tabakasının altına göç eden faz karartılmış lösemik hücreler.

Protocol

1. Ko-kültür içinde 3 Alt Popülasyonu Ayırmak

1. Süspansiyon (S) tümör alt popülasyonunun toplanması.
   1. Pipet ile ko-kültür plakasından besiyerini aspire edin ve plakayı durulamak için aynı besiyerini nazikçe yeniden uygulayın ve lösemik hücreler içeren besiyerini 15 ml'lik bir konik tüpte toplayın. Toplanan lösemik hücreler S alt popülasyonudur.
2. Faz Parlak (PB) tümör alt popülasyonunun toplanması.
   1. 10 ml taze besiyerini tekrar ko-kültür plakasına ekleyin. Yapışık lösemik hücreleri çıkarmak için ilave ortamı yaklaşık 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kuvvetlice durulayın, ancak yapışkan BMSC / OB bileşenini yerinden çıkaracak kadar sert değil.
   2. Pipetle aspire edin ve ortamı 15 ml'lik konik bir tüpte toplayın. Toplanan hücreler PB alt popülasyonudur.
3. Faz Dim (PD) tümör alt popülasyonunun toplanması.
   1. Kalan ortamı çıkarmak için plakayı 1 ml PBS ile durulayın. Ko-kültür plakasını 3 ml tripsin ile tripnize edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre koyun.
   2. Plakayı inkübatörden çıkarın ve yapışan BMSC / OB'yi çıkarmak için plakanın kenarlarına hafifçe vurun.
   3. 1 ml fetal sığır serumu (FBS) ekleyin ve büyük hücre agregatlarını parçalamak için 3-5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   4. 15 ml'lik konik bir tüpte hücreli ortamları toplayın. Bu hücreler aynı zamanda BMSC / OB ile saflaştırılmamış PD alt popülasyonudur.
4. 3 izole edilmiş alt popülasyonu 400 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve atın, ardından peletleri 1 ml önceden ısıtılmış ortamda ayrı ayrı yeniden süspanse edin. Hücreler bir G10 sütununa yüklenmeye hazırdır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml konik santrifüj tüpleri	Dünya Çapında Medikal Ürünler	41021039	Şunlar için koruyucu çözelti Sitoloji örnekleri
15 ml konik santrifüj tüpleri	Nova Çiçeği	Na	Hücre toplama için kullanılır
Fetal Sığır Serumu	Sigma	F6178
% 0.05 Tripsin	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
100 x 20 mm Hücre Kültürü Kapları	Greiner Bio-Bir	664160
Kültür ortamı
Osteoblast kültür ortamı	Promosyon Hücresi	C-27001	İnsan osteoblast ortamı için
RPMI 1640 ortamı	Medya Teknolojisi, Inc.	15-040	Tümör besiyeri hazırlığı için
Hücre satırları
İnsan Osteoblastları	Promosyon Hücresi	C-12720	İnsan osteoblastı, tedarikçinin tavsiyelerine göre kültürlendi.
İnsan Kemik Morrow Stromal Hücreleri	WVU Biyonumune Çekirdeği		Tanımlanmamış primer insan lösemisi ve kemik iliği stromal hücreleri (BMSC), Mary Babb Randolph Kanser Merkezi (MBRCC) Biyonumune İşleme Çekirdeği ve West Virginia Üniversitesi Patoloji Bölümü Doku Bankası tarafından sağlandı. BMSC kültürleri daha önce anlatıldığı gibi kurulmuştur (*)
Lösemik hücreler
Reh	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC-CRL-8286	REH hücreleri, tedarikçinin tavsiyelerine ve önerilen besiyerine göre kültürlendi.
SD-1	DSMZ (Türkçe)	ACC 366	SD-1, tedarikçinin tavsiyelerine ve tavsiye edilen ortamlara göre kültürlendi.