G-10 Kolon Tabanlı Lösemi Hücre Ayıklama: Akut Lenfoblastik Lösemi Hücrelerini Kemik İliği Stromal Hücrelerinden Saflaştırmak İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Slone, W. L.,et al. Kemoterapiye Dirençli Löseminin İn Vitro Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin kemik iliği stromal hücrelerinden jel tipi on çapraz bağlı dekstran G-10 sütunu kullanılarak ayrılması anlatılmaktadır. Bu yöntem, yapışık kemik iliği stromal hücrelerinin altına göç eden tümör hücrelerinin popülasyonunun geri kazanılmasına yardımcı olur ve bir "faz dim" tümör hücresi popülasyonu oluşturur.

Protocol

1. Ko-kültür Hücrelerinin G10 Sütununa Yüklenmesi

>NOT: G10 sütununa hücre içeren ortam eklemeden önce musluğun tamamen kapalı olduğundan emin olun. Ayrıca, aşağı akış analizinde popülasyonlar arasında herhangi bir önyargı oluşturmamak için her bir alt popülasyon ayrı bir G10 sütunu üzerinden çalıştırılmalıdır.

1. 1.000 μl'lik bir pipet kullanarak, önceden ısıtılmış ortamdaki her hücre alt popülasyonundan 1 ml'yi ayrı bir G10 sütununa damla damla ekleyin. Hücreleri içeren ortamın G10 peletinin üstünde veya içinde kaldığından emin olun. Hücrelerin RT.
   'da 20 dakika boyunca G10 pelet üzerinde inkübe etmesine izin verin not: Musluk kuluçka süresi boyunca kapalı kalır.

2. G10 Sütunundan Lösemik Hücrelerin Toplanması

1. Her G10 sütununa 1-3 ml önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Vanayı açın ve ortamın kolondan yavaşça damla damla çıkmasına izin verin.
   not: Kolondan yavaş bir akış hızının korunması çok önemlidir, aksi takdirde BMSC / OB içeren G10 peleti kolondan yıkanabilir ve izole edilen lösemik hücreleri kontamine edebilir.
2. Toplam 15 ila 20 ml sütundan geçene ve toplanana kadar G10 sütununa küçük artışlarla (1-2 ml) önceden ısıtılmış ortam eklemeye devam edin. Musluk vanasını ve kapak toplama borusunu kapatın.
   not: Toplama tüpünün dibinde bir G10 parçacık peleti görülürse, G10 parçacık peletini rahatsız etmeden bırakarak ortamı tüpten nazikçe çıkarın ve yeni tüpe aktarın.
3. Toplanan ortamı RT'de 7 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini aşağı akış uygulaması için uygun tamponda yeniden süspanse edin.
4. Hücreler artık BMSC veya OB kontaminasyonu içermeyen saf bir lösemik hücre popülasyonudur ve kullanıcının takdirine bağlı olarak aşağı akış uygulamalarına uygulanmaya hazırdır.
   NOT: Hücreleri G10 kolonlarından geçirirken lösemik hücre canlılığı değişmeden kalmalıdır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex boncuk	Sigma	G10120	El yazmasında jel tip 10 çapraz bağlı dekstran parçacıkları olarak anılır
10 ml steril şırınga	Bd	309604
1 yönlü musluklar	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	14054-10
İnsan Osteoblastları	Promosyon Hücresi	C-12720	İnsan osteoblastı, tedarikçinin tavsiyelerine göre kültürlendi.
İnsan Kemik Morrow Stromal Hücreleri	WVU Biyonumune Çekirdeği		Tanımlanmamış primer insan lösemisi ve kemik iliği stromal hücreleri (BMSC), Mary Babb Randolph Kanser Merkezi (MBRCC) Biyonumune İşleme Çekirdeği ve West Virginia Üniversitesi Patoloji Bölümü Doku Bankası tarafından sağlandı. BMSC kültürleri daha önce anlatıldığı gibi kurulmuştur (*)
% 0.05 Tripsin	Medya Teknolojisi, Inc.	25-053-CI
Reh	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC-CRL-8286	REH hücreleri, tedarikçinin tavsiyelerine ve önerilen besiyerine göre kültürlendi
Cam yünü	Borcam	3950
50 ml konik santrifüj tüpleri	Dünya Çapında Medikal Ürünler	41021039	Toplama tüpleri olarak kullanılır
15 ml konik santrifüj tüpleri	Dünya Çapında Medikal Ürünler	41021037	Hücre toplama için kullanılır
Fetal Sığır Serumu	Sigma	F6178
SD-1	DSMZ (Türkçe)	ACC 366	SD-1, tedarikçinin tavsiyelerine ve tavsiye edilen ortamlara göre kültürlendi
100 x 20 mm Hücre Kültürü Kapları	Greiner Bio-Bir	664160