Retro-Orbital Kan Örneklemesi: Bir Farenin Retro-Orbital Sinüsünden Mononükleer Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Mopin A. et al. Murine C1498 Hücre Hattını ve İlişkili Lösemi Fare Modelini Karakterize Etmek İçin Ayrıntılı Bir Protokol. J. Vis. Uzm. (2016)

Video, bir farenin retro-orbital sinüsünden periferik kan alımı ve yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile mononükleer hücrelerin kandan daha fazla izolasyonu için bir örnekleme yöntemini açıklar.

Protokol

1. Retro orbital kan toplama

1. Hipotermiyi önlemek için ötenaziden hemen önce steril koşullar altında, laminer akış başlığında ve bir ısıtma lambası altında retro orbital kan toplama işlemi gerçekleştirin.
2. Anestezi için 150 mg / kg'da ketamin ve 10 mg / kg'da ksilazin kullanın. 18 ml PBS çözeltisi içinde 1.5 ml ketamin ve 0.5 ml ksilazin seyrelterek anestezik çözeltiyi hazırlayın.
3. Gözün medial kantusuna bir kılcal tüp yerleştirin. Kan, orbital sinüsten kılcal boruya yükselecektir. Steril bir gazlı bezle göze hafifçe baskı uygulayarak kanamayı kontrol edin.
   not: Bu teknik kullanılarak 100 ila 200 μl kan hacmi toplanabilir.
4. Kanı bir EDTA tüpüne toplayın ve mononükleer hücreleri izole etmeden önce numuneyi buz üzerinde saklayın.

2. Kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu

1. Kan örneğini (100 ila 200 μl; adım 1.1'den elde edilir) bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve çözelti hacmi 500 μl olana kadar PBS / 1 mM EDTA çözeltisi ekleyin. 30 G'lik bir iğne ve 1 ml'lik bir şırınga kullanarak kanı içeren çözeltinin altına 500 μl ayırma solüsyonunu dikkatlice katmanlayın. Kanı ve ayırma solüsyonunu karıştırmayın.
2. Tüpleri RT'de 20 dakika boyunca 800 x g'da (frensiz) santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, bir pipet kullanarak hücresel halkayı (opak beyaz tabaka) toplayın. Hücreleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   not: Opak beyaz tabaka, monositlerin yanı sıra lenfositleri de içerir ve alt tabaka - ayırma çözeltisi - ile üst tabaka arasında görünür.
3. 1 ml PBS çözeltisi ekleyin ve tüpü 10 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 600 μl FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ketamin 1000 (100 mg / ml)	BAŞAK	3.59713E+12
Ksilazin SEDAXYLAN (20 mg / ml)	CEVA (Türkçe)
PBS çözeltisi (1x konsantre)	ThermoFisher Bilimsel	14190
Ultra Saf 0,5 M EDTA çözeltisi, pH 8,0	ThermoFisher Bilimsel	15575
Ayırma çözümü (Pancoll Mouse)	PANBIYOTEKNOLOJI	P04-64100
EDTA Tüpü	Greiner Bio-Bir	454034
Pasteur Pipet 150 mm (kılcal boru)	Balıkçı markası	1154-6963
Akış sitometri tüpleri (mavi)	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	2523749
Mikrosantrifüj tüpü (1.5 ml)	ThermoFisher Bilimsel	05-408-129
Steril gazlı bez süngerler	URGO (URGO)	501580
30 G iğne	Becton ve Dickinson	304000
1 ml şırınga	Terumo	SS-01T
Shandon Cytospin 3 Sitosantrifüj	ThermoFisher Bilimsel