$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. C1498 Hücre Hattının In vitro Karakterizasyonu
- C1498 hücrelerinin in vitro kültürü
- 50 ml fetal sığır serumu (FBS), 5 ml penisilin (100 U/ml)-streptomisin (100 μg/ml), 500 μl 50 mM β-merkaptoetanol, 5 ml N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES), 5 ml esansiyel olmayan amino asit ve 500 ml RPMI ortamına 5 mL sodyum piruvat ekleyerek tam RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortamı hazırlayın.
- C1498 hücre hattını tam RPM'de büyütün. Hücreleri pipetleme ile süspansiyon halinde toplayın ve hücreleri 50 ml'lik bir tüpe aktarın. 350 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- 20 ml fosfat tamponlu salin (PBS) (1x) çözeltisi ekleyin, 350 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri 10 ml Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralayıcı (FAC) tamponunda (2.5 g sığır serum albümini (BSA) tozu ve 500 ml PBS çözeltisinde 2 ml 0.5 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri tripan mavisi ile boyadıktan sonra bir Thoma hücre sayma odası kullanarak hücreleri sayın.
2. Mikroskopi için slaytlar üzerinde bir hücre süspansiyonunun hazırlanması
- Hasat edilen C1498 hücrelerinin (adım 1.1.4'te elde edilen) 106'sını 5 ml soğuk FAC tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri 1 ml soğuk FAC tamponu içinde seyreltin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
- Slaytları önceden takılmış filtre kartlarıyla tek kullanımlık odalara yerleştirin ve bunları bir sitosantrifüje yerleştirin.
- Her hazneye ve filtre kartına 100 μl FAC tamponu ekleyin ve bunları 4.52 x g'da 2 dakika döndürün.
- Her hazneye ve filtre kartına 100 μl hücre ekleyin ve hücreleri 2 dakika boyunca 4.52 x g'da döndürün.
- Slaytları haznelerden dikkatlice çıkarın ve May-Grünwald Giemsa lekesi ile lekelemeden önce slaytları havayla kurutun.
3. May-Grünwald Giemsa (MGG) boyama
- Slaytları May-Grünwald solüsyonu içeren bir Coplin kavanozuna 3 dakika daldırarak hücreleri (bölüm 2'de hazırlanmıştır) boyayın.
- Slaytları 1 dakika boyunca pH 6.8 tampon çözeltisi içeren bir Coplin kavanozuna aktarın.
- Slaytları 10 dakika boyunca Giemsa R solüsyonu (pH 6.8 tampon solüsyonunda 1/20'ye seyreltilmiş) içeren bir Coplin kavanozuna koyarak boyayın. Slaytları nötr suyla (pH 7) 10 saniye yıkayın.
- Slaytları boşaltın ve havayla kurutun. Hücrelere bir damla montaj ortamı 2 uygulayarak kızakları monte edin. Kapak camının bir kenarını sürgünün üzerine yerleştirin ve forseps kullanarak dikkatlice hücrelerin üzerine indirin. Hava kabarcıklarını gidermek için kapak camına hafifçe bastırın.