Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme: CLL Hücrelerini Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Hay, J. et al. Nükleer/Sitoplazmik Protein Kaçakçılığını İzlemek için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subselüler Fraksiyonasyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinin periferik kandan izole edilme tekniği açıklanmaktadır. Bu protokolle, daha sonra nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların verimli bir şekilde üretilmesi için insan hasta kan örneğinden KLL hücrelerini izole edeceğiz.

Protocol

1. Hasta Kan Örneklerinden KLL Hücrelerinin İzolasyonu

1. Daha önce onay verilen KLL hastalarından alınan periferik kan örnekleri, beyaz hücre sayımı (WCC) eşliğinde EDTA'lı kan alma tüplerinde klinikten alınır. Periferik kan CLL örneklerini WCC'ye göre saflaştırın. WCC < 40 x 10⁶ hücre/mL için adım 1.1.1'e geçin; WCC ≥ 40 x 10⁶ hücre/mL için adım 1.1.2'ye geçin.
   1. Tüm EDTA kan tüplerinin içeriğini 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne dökün ve 1 mL kan başına 50 μL İnsan B Hücresi Zenginleştirme Kokteyli ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin. Adım 1.1.2'ye ilerleyin.
   2. Numuneyi RT CLL yıkama tamponu (fosfat tamponlu salin (PBS),% 0.5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 2 mM EDTA) ile 1: 1 oranında seyreltin.
2. RT yoğunluk gradyan ortamını numune için uygun boyutta bir konik santrifüj tüpüne alikotlayın (30 mL numune için 50 mL'lik bir tüpe 10 mL veya 10 mL numune için 15 mL'lik bir tüpe 4 mL).
3. Numuneyi dikkatlice yoğunluk gradyan ortamının üzerine yerleştirin ve RT.
   'de 30 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin NOT: Numuneler santrifüje yerleştirilmeden önce santrifüjün RT'de olduğundan emin olun, çünkü sıcaklıktaki bir değişiklik mononükleer hücrelerin zayıf zenginleşmesine neden olur ve ani frenleme sıvı arayüzünü bozabileceğinden santrifüj üzerindeki freni kapatın.
4. Yoğunluk gradyan ortamının ve CLL yıkama tamponunun arayüzünde toplanan beyaz mononükleer hücre tabakasını, plastik bir Pasteur pipeti kullanarak 50 mL'lik yeni bir konik santrifüj tüpüne nazikçe ekleyin.
5. Hücreleri yıkamak için izole edilmiş tek tabakaya 40 mL CLL yıkama tamponu ekleyin ve RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
6. Süpernatanı atın, tüpün altına hafifçe vurarak peleti yeniden süspanse edin, ardından adım 1.5'te açıklanan yıkama adımını tekrarlayın.
7. Süpernatanı atın, peleti adım 1.6'da açıklandığı gibi yeniden süspanse edin, ardından peleti ayarlanmış bir hacimde CLL yıkama tamponunda (hücre peletinin boyutuna bağlı olarak 40 mL'ye kadar) yeniden süspanse edin.
8. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra KLL hücrelerinin saflığını kontrol etmek için akış sitometrisine devam edin.
   NOT: Bu aşamada, KLL hücreleri, deneylerde kullanılacak ortamda 10 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda kültürlenebilir ve/veya gelecekteki çalışmalar için 100 x 10⁶ hücre/flakon
.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Tüp	Griener Biyografisi bir	188271
1.5 mL mikrosantrifüj Tüpleri	Griener Biyografisi bir	616201
DMSO (Türkçe)	Sigma	D2650
Edta	Sigma	Eds
Fetal Sığır Serumu	Termo Balıkçı	10500064
Histopaque1077 yoğunluk gradyan ortamı	Sigma	H8889
Tripan Mavisi Çözeltisi	Termo Balıkçı	15250061
PBS Tabletler	Balıkçı Bilimsel	BR0014G
RosetteSep İnsan B Hücresi Zenginleştirme Kokteyli	Kök Hücre Teknolojileri	15064
Sigma 3-16P	SciQuip (İngilizce)		merkezkaç