$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. CLL Hücrelerinden Hücre Altı Fraksiyonların Hazırlanması
NOT: Deney kurulumunu planlarken, tüm hücre ekstraktının üretilebileceği uyarılmamış/işlenmemiş hücrelerden oluşan bir kuyu ekleyin.
- 10 – 20 x 106 hücre/koşul kullanarak MEC1 CLL hücre hattının veya izole edilmiş birincil KLL hücrelerinin istenen stimülasyonunu ve/veya ilaç tedavisini gerçekleştirin. Hücreler daha sonra hücre altı fraksiyonlama için veya aşağıda açıklandığı gibi tam hücre özütü oluşturmak için kullanılacaktır:
- Çözeltilerin/tüplerin hazırlanması: Hücreler hasat edilmeden önce tüm çözeltileri/tamponları fraksiyonlama gününde taze olarak hazırlayın. Solüsyonları gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın ve hazırlandıktan sonra 4 saat içinde kullanın.
- PBS / fosfataz inhibitör çözeltisi: Fosfataz inhibitörlerini 1x PBS'de 1:20 oranında seyrelterek PBS'de fosfataz inhibitörlerini hazırlayın (ör., 9.5 mL 1x PBS'de 0.5 mL fosfataz inhibitörleri).
not: Fosfataz inhibitörlerinin çökelmediğinden emin olun. Bir çökelti varsa, 10 dakika boyunca 50 ° C'ye ısıtın.
- Hipotonik tampon: Damıtılmış suda 10x hipotonik tamponun 1:10 oranında seyreltilmesi yaparak 1x hipotonik tampon hazırlayın (yani, 50 μL 10x hipotonik Tampon 450 μ L dH2O'ya).
- 10 mM ditiotreitol (DTT): Damıtılmış su ile 1M DTT'nin 1:100 seyreltmesini yaparak 10 mM DTT hazırlayın (yani, 990 μL dH2O'da 10 μL 1 M DTT).
not: DTT oldukça kararsızdır, bu yüzden bunu her seferinde taze olarak hazırlayın. Tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının.
- Tam lizis tamponu: Her deney için ne kadar tampon gerektiğini belirleyin. Her numune 50 μL tam lizis tamponu gerektirir, bu nedenle 44.5 μL lizis tamponuna 5 μL 10 mM DTT ekleyin ve ardından 0.5 μL proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Bu miktar, deneydeki numune sayısına bağlı olarak ölçeklendirilebilir.
- Yeni uyarılmış hücreler, yeni oluşturulmuş sitoplazmik fraksiyonlar, yeni üretilmiş nükleer fraksiyonlar ve tüm hücre lizatları için her stimülasyon ve/veya ilaç tedavisi için dört set 1.5 mL mikrofüj tüpü etiketleyin. Bu mikrofüj tüplerini gerekene kadar buz üzerinde önceden soğutun.
- Hücreleri ayrı ayrı etiketlenmiş 1.5 mL mikrofüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyerek pelet haline getirin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL buz gibi soğuk PBS / fosfataz inhibitörlerinde yeniden süspanse edin. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini buz üzerinde tutun.
- Sitoplazmik fraksiyonların hazırlanması: 50 μL 1x hipotonik Tampon içinde hücre altı fraksiyonlama için kullanılacak hücre peletlerini nazikçe yeniden süspanse edin. Hücrelerin şişmesini sağlamak için hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
not: Kullanılan hipotonik tamponun hacmi, hücre sayısına bağlı olarak ampirik olarak arttırılabilir.
- Her numuneye 0,8 - 2,5 μL (1:20 ila 1:60) deterjan ekleyin ve en yüksek ayarda 10 saniye boyunca döndürün.
- Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonları izole etmek için belirli bir hücre tipi için kullanılacak optimum deterjan konsantrasyonunu belirlemek için, başlangıçta bir deterjan gradyanı gerçekleştirin. 1:20 ila 1:60 aralığı (yani, 50 μL Hipotonik Tampona 2,5 μL ila 0,8 μL deterjan) yeterli olmalıdır.
not: Adım 3.4'teki hipotonik tampon hacmi ayarlanırsa, uygun deterjan oranının korunduğundan emin olun.
- Deterjan ilavesinden önce ve sonra bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri gözlemleyerek hücre lizizini doğrulayın. Bütün hücreler yoğun, koyu renkli bir çekirdeğe sahip daha büyük görünür. Sitoplazma, çekirdeğin etrafında parlak bir hale olarak görünecektir.
not: Uygun lizis, deterjan gradyanından üretilen parçalanmış fraksiyonlar içindeki spesifik proteinleri analiz etmek için Western blotlama kullanılarak daha da doğrulanır.
- Parçalandıktan sonra, numuneleri 4 ° C'de 30 saniye boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice önceden soğutulmuş, etiketlenmiş bir mikrofüj tüpüne aktarın. Bu sitoplazmik fraksiyon, daha fazla analiz için gerekli olana kadar -80 °C'de saklanabilir. Kalan pelet nükleer fraksiyonu içerir.
not: Numunelerin tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının.
- Nükleer fraksiyonların hazırlanması: Her bir nükleer peleti 50 μL'lik tam lizis tamponunda yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
NOT: Tam lizis tamponunun hacmi, başlangıç hücre numarasına göre ampirik olarak ayarlanabilir.
- Nükleer zar ile ilişkili proteinleri çözündürmek için 2,5 μL deterjan ekleyin ve en yüksek ayarda 10 saniye boyunca girdap yapın. Numuneleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- En yüksek ayarda 30 saniye boyunca vorteksleyin, ardından numuneleri 14.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı önceden soğutulmuş, etiketlenmiş bir mikrofüj tüpüne aktarın. Bu nükleer fraksiyon, daha fazla analiz için gerekli olana kadar -80 °C'de saklanabilir.
not: Numunelerin tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının.