1. Reaktiflerin Hazırlanması
- 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, ddH2O'da çözerek 500 mL PBS hazırlayın. HCl ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Otoklavlama ile sterilize edin.
- 100 mL RPMI ortamı hazırlayın: % 10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş L-Alanil-Glutamin içeren RPMI-1640 ortamı.
- Damıtılmış suda 50 mL 0.1 M NaHCO3 hazırlayın. PH'ı 8.1'e ayarlayın, filtreyle sterilize edin (0.22 μm) ve 4 °C'de saklayın.
not: İki adet 8 oyuklu hücre dışı akı analizörü plakası için 250 μL 0,1 M NaHCO3 pH 8,1 hazırlayın.
- Damıtılmış suda 1 mL 2 M D-glikoz hazırlayın. Filtreyle sterilize edin (0,22 μm) ve -20 °C'de saklayın.
- Etanol içinde 100 μL 1 mM Oligomisin A hazırlayın. Filtreyle sterilize edin (0,22 μm) ve -20 °C'de saklayın.
- Minimal DMEM'de (Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı) 250 μL 1 M 2-deoksi-D-glikoz (2-DG) hazırlayın. 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın (pH ölçümünü 37 °C'de gerçekleştirin). Filtreyle sterilize edin (0,22 μm) ve -20 °C'de saklayın.
- DMSO'da 100 μL 1 mM FCCP (karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazon) hazırlayın. Filtreyle sterilize edin (0,22 μm) ve -20 °C'de saklayın.
- Etanolde 100 μL 1 mM Rotenon hazırlayın. Filtreyle sterilize edin (0,22 μm) ve -20 °C'de saklayın.
- Etanol içinde 100 μL 1 mg / mL Antimisin A hazırlayın. Filtreyle sterilize edin (0,22 μm) ve -20 °C'de saklayın.
- Kullanımdan hemen önce 10 mL Glikoliz stres testi ortamı hazırlayın. Minimal DMEM'i bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın (pH ölçümünü 37 °C'de yapın).
- Kullanmadan önce, BSA ile 10 mL Cell Mito stres testi ortamı hazırlayın. Minimal DMEM'i 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glukoz, 1 mM HEPES (pH 7.4), 1 mM piruvat ve% 0.1 BSA (sığır serum albümini) ile destekleyin. Bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın (pH ölçümünü 37 °C'de yapın).
- Kullanmadan önce, BSA içermeyen 10 mL Cell Mito stres testi ortamı hazırlayın. Minimal DMEM'i 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glikoz, 1 mM HEPES (pH 7.4) ve 1 mM piruvat ile destekleyin. BSA içermeyen Cell Mito stres test ortamını bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın (pH ölçümünü 37 °C'de gerçekleştirin).
NOT: BSA, Hücre Mito stres testi ortamına eklenir, çünkü ortam BSA ile desteklendiğinde hücreler FCCP'ye daha iyi yanıt verir (farklı koşullar test edilmiştir). BSA'sız Cell Mito stres testi ortamı, üretici ortamda BSA kullanılmasını önermediğinden, bağlantı noktalarını yüklemek için kullanılır.
2. Mononükleer Hücrelerin Gece Boyunca Yetiştirilmesi
>NOT: Tüm alt adımları steril bir doku kültürü başlığında gerçekleştirin.
- 75 mL RPMI ile iki T20 şişesi hazırlayın. Her şişeye 30 x 106 izole mononükleer hücre ekleyin. Hücreleri, şişe %5 CO2 ve 37 ° C'de 16-24 saat ayakta kalacak şekilde inkübe edin.
3. Hücre Yapıştırıcı Kaplı Plakaların Hazırlanması
- İki adet 8 oyuklu hücre dışı akı analizörü plakasını kaplayın.
not: Kaplamayı steril bir doku kültürü başlığında gerçekleştirin.
- 250 μL 0.1 M NaHCO3, pH 8.1'e 2.2 μL hücre yapıştırıcısı (yoğunluk: 2.54 mg / ml) ekleyin ve hemen 12.5 μL çözeltiyi her bir oyuğa pipetleyin.
not: Hücre yapışkan stok çözeltileri yoğunluklarına göre farklılık gösterebilir, NaHCO3'e eklenen hacmi buna göre ayarlayın.
- Plakaları yaklaşık 20 dakika davlumbazda bekletin, ardından hücre yapıştırıcısını aspire edin ve her bir kuyuyu 200 μL steril su kullanarak iki kez yıkayın. Kuyular kuruyana kadar kapağı açık olarak davlumbazda bekletin.
- Plakaları hemen kullanın veya yoğuşmayı önlemek için kenar parafin filmle sarılmış halde 4 °C'de 1 haftaya kadar tasarruf edin. Hücreleri tohumlamadan önce plakaların davlumbazda oda sıcaklığına (yaklaşık 20 dakika) kadar ısıtıldığından emin olun.
4. Sensör Kartuşunun Hidrasyonu
>NOT: İki adet 8 oyuklu hücre dışı akı analizörü kartuşunu nemlendirin.
- Yardımcı plakayı ve sensör kartuşunu ayırın. Sensör kartuşunu laboratuvar tezgahının üzerine baş aşağı yerleştirin.
- Yardımcı plakanın her bir kuyusunu 200 μL kalibrant ile doldurun. Kuyuların dışındaki her hendeği 400 μL kalibrant ile doldurun.
- Sensör kartuşunu şimdi kalibantı içeren yardımcı plakaya geri koyun.
- Kartuş tertibatını gece boyunca nemlendirilmiş, CO2, 37 °C olmayan bir inkübatöre yerleştirin.
- Hücre dışı akı analizörünü açın ve gece boyunca 37 °C'ye ısınmasına izin verin.
5. Hücre Yapıştırıcı Kaplı Plakalarda Tohumlama Hücreleri
>NOT: Glikoliz stres testi için Glikoliz stres testi ortamını kullanın. Cell Mito stres testi için, BSA ile Cell Mito stres testi ortamını kullanın.
- Glikoliz stres testi ve Hücre Mito stres testi için tohum hücreleri ayrı plakalarda. Her test için, gece boyunca kültür içeren bir şişeden hücreler kullanın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri uygun ortamın 1 mL'sinde yeniden süspanse edin ve sayın.
- 400 μL'lik son hacme 4 x 106 canlı hücre ekleyin (uygun ortam kullanın).
- Hücre süspansiyonunun 50 μL plakasını B-G kuyularına yerleştirin. Bir kuyuda 500.000 hücrenin tohumlandığından emin olun.
not: Kuyu başına tam olarak 500.000 hücreyi tohumlamak çok önemlidir ve başka bir normalizasyon yapılmaz. Bu şekilde, farklı hastalardan elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir. En uygun kopya sayısı, burada açıklandığı gibi altıdır. Birincil hücreler bazen hatalı davranabileceğinden daha az kopya kullanılması önerilmez.
- A ve H kuyucuklarına 180 μL uygun ortam ekleyin (bu kuyucuklar bir arka plan düzeltmesi görevi görecektir).
- Plakayı, freni 1'e ayarlanmış olarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- İki adet 8 oyuklu hücre dışı akı analizörü plakasında yavaş ve dikkatli bir şekilde B-G kuyularına 130 μL uygun ortam ekleyin. Mikroskop altında görüntüleyerek hücrelerin kuyucukların dibine stabil bir şekilde yapıştığını görsel olarak onaylayın.
- Plakayı 30 dakika boyunca nemlendirilmiş, CO2, 37 °C olmayan bir inkübatöre yerleştirin.
6. Sensör Kartuşunu Yükleme
- Glikoliz stres testi için, tümü Glikoliz stres testi ortamında 250 μL'lik 100 mM glikoz, 20 μM Oligomisin A ve 1 M 2-DG hazırlayın.
- Hücre Mito stres testi için, her biri 20 μM Oligomisin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP ve 10 μM Rotenon ve 10 μg / ml Antimisin A karışımından 250 μL hazırlayın, tümü BSA.
not: FCCP titrasyonu için yeterli hasta materyali olmadığı için bir testte iki konsantrasyonda FCCP enjekte edilmesi önerilir. Bununla birlikte, konsantrasyonlar araştırmacı tarafından belirlenmelidir.
- Bileşikleri kartuşun uygun enjektör portlarına aşağıdaki gibi yükleyin (Tablo 1):
7. Programın Kurulması
- Glikoliz stres testi için programı Tablo 2'de açıklandığı gibi ayarlayın.
- Hücre Mito stres testi için programı Tablo 3'te açıklandığı gibi kurun.
- Programı başlatın. Kalibant plakasını tahlil plakasıyla değiştirin (istendiğinde).
| liman | Glikoliz stres testi | >Hücre mito stres testi |
| Limana yükleyin | Kuyulardaki son konsantrasyon | Limana yükleyin | Kuyulardaki son konsantrasyon |
| Bir | 20 μL 100 mM glikoz | 10 mM glikoz | 20 μL 20 μM Oligomisin A | 2 μM Oligomisin A |
| B | 22 μL 20 μM Oligomisin A | 2 μM Oligomisin A | 22 μL / 15 μM FCCP | 1,5 μM FCCP |
| Ç | 25 μL 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL 30 μM FCCP | 4,5 μM FCCP |
| D | Devamı | | 25 μL 10 μM Rotenon ve 10 μg/ml Antimisin A | 1 μM Rotenon ve 1 μg/ml Antimisin A |
Tablo 1: Bileşik hacimler.
| adım | Ayarlar |
| Kalibrasyon | Otomatik |
| Dengeleme | Otomatik |
| Referans değer ölçümü | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| A portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| B portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| C portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Dört kez: Karıştır – 3 dk, Bekle – 0 dk, Ölçün – 3 dk |
Tablo 2: Glikoliz stres testi programı.
| adım | Ayarlar |
| Kalibrasyon | Otomatik |
| Dengeleme | Otomatik |
| Referans değer ölçümü | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| A portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| B portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| C portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
| D portunun enjeksiyonu | enjeksiyon |
| ölçüm | Üç kez: Karıştır - 3 dk, Bekle - 0 dk, Ölç - 3 dk |
Tablo 3: Hücre Mito stres testi programı.
