T-Hücresi Zenginleştirme: Manyetik Ayırma ile Karışık Hücre Popülasyonundan T-Hücrelerini İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Nguyen, H. D., et al. Graft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak İçin Kemik İliği Nakli Platformu. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, manyetik ayırıcı kullanılarak negatif seçilimle farenin dalağından T hücrelerinin zenginleştirilmesi anlatılmaktadır. Teknik, spesifik hücre yüzeyi antijenlerine karşı yönlendirilmiş antikorlar veya ligandlar kullanılarak numunedeki diğer hücrelerin tükenme için hedeflenmesini içerir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. 1. Gün: Donör farelerden T hücrelerini hazırlayın

1. CD45.2 ⁺ H2k^{b +} C57BL / 6 vahşi tip (WT) fareleri T hücreleri için donör olarak kullanın.
2. C57BL / 6 fareleri karbondioksit (CO₂) boğulması ile ötenazi yapın ve bilinçlerini kaybedene kadar 2-3 dakika bekleyin. Gerekirse ikincil ötenazi olarak servikal çıkık yapın.
3. Farenin kürkünü ve derisini %70 etanol ile iyice temizleyin. Dalakları ve lenf düğümlerini eksize edin ve bunları bir şırınga pistonu ve 40 μm ağ süzgeçleri kullanarak tek hücreli bir splenosit süspansiyonuna ayırın. Tüm splenositleri toplamak için süzgeci ve şırınga pistonunu %1 RPMI (%1 RPMI ortamı içeren FBS) ile yıkayın.
4. Hücre süspansiyonunu 800 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra 5 mL ACK parçalama tamponu (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7.2) ekleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   not: ACK lizis tamponu, kırmızı kan hücrelerini parçalamak için kullanılır.
5. Lizizi durdurmak için 5 mL% 1 RPMI ekleyin. 800 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
6. Buz gibi soğuk manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama (MACS) tamponu hazırlayın (% 0.5 BSA, PBS'de 2 mM EDTA, pH 7.2). Kullanmadan önce tamponun gazını alın. Hücre peletlerini 5 mL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
7. Splenositleri sayın ve bir hemositometre ve% 1 tripan mavisi kullanarak canlı ve ölü hücreleri kontrol edin. Akış sitometrisi analizi ile saflaştırma verimini değerlendirmek için 2 x 10⁶ hücreli bir alikot kaydedin.
8. Splenositleri MACS tamponunda 200 x 10⁶ / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. 10⁶ hücre başına 0.03 μL biotin anti-fare-Ter-119, 0.03 μL biotin anti-fare-CD11b, 0.03 μL biotin anti-fare-CD45R ve 0.03 μL biotin anti-fare-DX5 ekleyin. 4 °C'de 15 dakika inkübe edin
   not: Eritroid, granülositler, B hücreleri ve NK hücreleri ile reaksiyona girmek için sırasıyla biyotin anti-fare-Ter-119, biyotin anti-fare-CD11b, biyotin anti-fare-CD45R ve biyotin anti-fare-DX5 kullanıldı. Bu nedenle, bu hücre alt kümeleri bir sonraki adımda tükenir.
9. Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi soğuk MACS tamponu ekleyin. 800 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
10. MACS tamponundaki hücre peletlerini 100 x 10⁶/mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Splenosit süspansiyonuna anti-biyotin mikroboncukları (0.22 μL / 10⁶ hücre) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika daha inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 10 mL buz gibi soğuk MACS tamponu ile bir kez yıkayın. 800 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
11. Manyetik alana manyetik bir ayırma sütunu koyun. Kolonu 3 mL MACS tamponu ile durulayın. Hücre süspansiyonunu sütuna bırakın. Bağlanmamış, zenginleştirilmiş T hücrelerinden oluşan akışı 15 mL'lik yeni bir konik tüpte toplayın. MS kolonunu 3 mL buz gibi soğuk MACS tamponu ile yıkayın.
    not: Yıkama adımlarını gerçekleştirmeden önce kolonun boş olduğundan emin olun.
12. Hücre süspansiyonunu 800 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini 5 mL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
13. Bir hemositometre kullanarak hücreleri %1 tripan mavisi içinde sayın. Akış sitometrisi ile saflık kontrolü için 2 x 10⁶ hücreli bir alikotu kaydedin.
    not: Bu yöntemle izole edilen splenik T hücrelerinin ortalama verimi, fare başına ~ 20−25 x 10⁶ hücredir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
dev/dak 1640	Thermo Fisher Bilimsel	11875-093	medya
MidiMACS (Mikro Teknoloji)	Miltenyi Biyotec	130-042-302	T hücresi zenginleştirme
0,5 M EDTA pH 8,0 100ML	Balıkçı Bilimsel	BP2482100	MACS arabelleği
10 kat PBS	Balıkçı Bilimsel	BP3994	MACS arabelleği
Anti-Biotin Mikro Boncuklar	Miltenyi Biyotec	130-090-485	T hücresi zenginleştirme
Anti-İnsan/Fare CD45R (B220)	Thermo Fisher Bilimsel	13-0452-85	T hücresi zenginleştirme
Anti-Fare CD4 Biotin	Thermo Fisher Bilimsel	13-0041-86	T hücresi zenginleştirme
CD11b	Thermo Fisher Bilimsel	13-0112-85	T hücresi zenginleştirme
CD25-biyotin	Thermo Fisher Bilimsel	13-0251-82	T hücresi zenginleştirme
CD45R	Thermo Fisher Bilimsel	13-0452-82	T hücresi zenginleştirme
CD49b Monoklonal Antikor (DX5)-biyotin	Thermo Fisher Bilimsel	13-5971-82	T hücresi zenginleştirme
Anti-Fare TER-119 Biotin	Thermo Fisher Bilimsel	13-5921-85	T hücresi zenginleştirme
Anti-fare CD45.1 PE	Thermo Fisher Bilimsel	12-0900-83	Akış sitometrisi analizi
C57BL/6 fare	Charles Nehri	27	Bağışçılar/Alıcılar
Akış sitometri tüpleri	Balıkçı Bilimsel	352008	Akış sitometrisi analizi
Hücre süzgeci 40 uM	Thermo Fisher Bilimsel	22363547	Hücre hazırlığı

Serisi Serisi