Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Özet

Source:Nguyen, H. D., et al. Graft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak için Kemik İliği Nakli Platformu. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Protokol

1. Kemik iliğinden türetilmiş dendritik hücreler (BM-DC'ler) oluşturun.

1. B6 arka planındaki WT veya faktör B (fB) ^-/- farelerin femurlarından ve tibiaslarından kemik iliğini izole edin. Kısacası forseps ve makas kullanarak her iki bacağınızdan tibia ve uyluk kemiğini toplayın. 50 mL konik tüplerde %1 FCS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin (%1 RPMI) içeren buz gibi RPMI'ye koyun. Forseps ve makas kullanarak tüm kas dokularını çıkararak uyluk kemiği ve kaval kemiği kemiklerini iyice temizleyin. Femur ve tibiayı 50 mL'lik konik tüplerden %1 rpmi içeren 92 mm çapında bir Petri kabına aktarın. Makas kullanarak uyluk kemiği veya tibianın uçlarını kesin. 50 mL'lik bir tüpü 25 mL% 1 RPMI 1640 ortamı ile doldurun. 26 G'lik bir iğneye bağlı 3 mL'lik bir şırıngayı 3 mL %1 RPMI ile doldurmak için bunu kullanın. Bu şırıngayı kemiğe yerleştirin ve kemik iliğini (BM) boşluktan %1 RPMI (~ 3 mL / kemik) ile toplama tüpüne akıtmak için pistonu itin. Hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
2. Kırmızı kan hücresi lizizi için peleti 5 mL ACK parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Lizizi durdurmak için hücre süspansiyonuna 10 mL% 1 RPMI ekleyin ve 800 x g'da 5 ° C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
3. Hücre peletlerini 10 mL kültür ortamında (%10 FBS, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 50 mM β-merkaptoetanol içeren RPMI 1640) yeniden süspanse edin ve hacmi 2 x 10⁶ hücre/mL'lik nihai konsantrasyonu karşılayacak şekilde ayarlayın.
4. Hücre süspansiyonuna 20 ng / mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyin. Kemik iliği hücrelerini 100 x 15 mm'lik Petri kaplarında 37 °C'de %5 CO₂ içinde 6 gün boyunca kültürleyin.
5. Devam eden kültür ortamının yarısını (yaklaşık 5 mL) 3. günde 40 ng / mL GM-CSF içeren taze ortamla değiştirin.
6. Kültür ortamını 37 ° C'de bir su banyosunda önceden ısıtın. Kemik iliği kültürü kaplarından yaklaşık 5 mL ortam toplayın. 800 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini 40 ng/mL GM-CSF içeren 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
7. BM-DC'leri olgunlaştırmak için kültürün 6. gününde ortama 25 μg / mL lipopolisakkarit (LPS) ekleyin. Akış sitometrisi ile DC farklılaşma etkinliğini belirlemek için 2 x 10⁶ hücreli bir alikot kaydedin.
8. Olgunlaşmış BM-DC'leri toplayın: DC'leri Petri kaplarından yumuşak bir şekilde sıyırmak için hücre kaldırıcılar kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını 50 mL'lik konik tüplerde toplayın. 800 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletlerini 3x 50 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Akış sitometrisi ile immünolojik fenotip analizi için yaklaşık 2 x 10⁶ BM-DC tasarruf edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 kat PBS	Balıkçı Bilimsel	BP3994	MACS arabelleği
B6 fB-/- fareler	Central Florida Üniversitesi	Evde	Alıcı
B6. Ly5.1 (CD45.1 + ) fareler	Charles Nehri	546	Bağış
BALB/c fareler	Charles Nehri	28	Nakil alıcıları
C57BL/6 fare	Charles Nehri	27	Bağışçılar/Alıcılar
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Atlanta Bilogicals Ar-Ge sistemi	D17051	Hücre Kültürü
Lipopolisakarit (LPS)	Kırlangıç Sigma	L4391-1MG	DC olgun
Yeni Brunswick Galaxy 170R kuluçka makinesi	Eppendorf Belediyesi	Gökada 170 R	Hücre Kültürü
Penisilin + streptomisinPenisilin / Streptomisin (10.000 ünite penisilin / 10.000 mg / ml strep)	GIBCO Bilişim Teknolojileri	15140	medya
dev/dak 1640	Thermo Fisher Bilimsel	11875-093	medya