Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

1. Kemik iliğinden türetilmiş dendritik hücreler (BM-DC'ler) oluşturun.

1. B6 arka planındaki WT veya faktör B (fB) ^-/- farelerin femurlarından ve tibiaslarından kemik iliğini izole edin. Kısacası forseps ve makas kullanarak her iki bacağınızdan tibia ve uyluk kemiğini toplayın. 50 mL konik tüplerde %1 FCS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin (%1 RPMI) içeren buz gibi RPMI'ye koyun. Forseps ve makas kullanarak tüm kas dokularını çıkararak uyluk kemiği ve kaval kemiği kemiklerini iyice temizleyin. Femur ve tibiayı 50 mL'lik konik tüplerden %1 rpmi içeren 92 mm çapında bir Petri kabına aktarın. Makas kullanarak uyluk kemiği veya tibianın uçlarını kesin. 50 mL'lik bir tüpü 25 mL% 1 RPMI 1640 ortamı ile doldurun. 26 G'lik bir iğneye bağlı 3 mL'lik bir şırıngayı 3 mL %1 RPMI ile doldurmak için bunu kullanın. Bu şırıngayı kemiğe yerleştirin ve kemik iliğini (BM) boşluktan %1 RPMI (~ 3 mL / kemik) ile toplama tüpüne akıtmak için pistonu itin. Hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
2. Kırmızı kan hücresi lizizi için peleti 5 mL ACK parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Lizizi durdurmak için hücre süspansiyonuna 10 mL% 1 RPMI ekleyin ve 800 x g'da 5 ° C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
3. Hücre peletlerini 10 mL kültür ortamında (%10 FBS, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 50 mM β-merkaptoetanol içeren RPMI 1640) yeniden süspanse edin ve hacmi 2 x 10⁶ hücre/mL'lik nihai konsantrasyonu karşılayacak şekilde ayarlayın.
4. Hücre süspansiyonuna 20 ng / mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyin. Kemik iliği hücrelerini 100 x 15 mm'lik Petri kaplarında 37 °C'de %5 CO₂ içinde 6 gün boyunca kültürleyin.
5. Devam eden kültür ortamının yarısını (yaklaşık 5 mL) 3. günde 40 ng / mL GM-CSF içeren taze ortamla değiştirin.
6. Kültür ortamını 37 ° C'de bir su banyosunda önceden ısıtın. Kemik iliği kültürü kaplarından yaklaşık 5 mL ortam toplayın. 800 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini 40 ng/mL GM-CSF içeren 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
7. BM-DC'leri olgunlaştırmak için kültürün 6. gününde ortama 25 μg / mL lipopolisakkarit (LPS) ekleyin. Akış sitometrisi ile DC farklılaşma etkinliğini belirlemek için 2 x 10⁶ hücreli bir alikot kaydedin.
8. Olgunlaşmış BM-DC'leri toplayın: DC'leri Petri kaplarından yumuşak bir şekilde sıyırmak için hücre kaldırıcılar kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını 50 mL'lik konik tüplerde toplayın. 800 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletlerini 3x 50 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Akış sitometrisi ile immünolojik fenotip analizi için yaklaşık 2 x 10⁶ BM-DC tasarruf edin.