$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fiksasyon, Hücre Lizizi ve Kromatin Kesme
>NOT: Hasta numuneleri ve Jurkat hücreleri, daha önce açıklandığı gibi değişikliklerle üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir ChIP kiti ile sabitlenir ve parçalanır. Sabitleme, laminer bir akış başlığı altında gerçekleştirilir.
- 1 mL% 37 formaldehit içeren 1.5 mL'lik bir tüp, 1 mL 1.25 M glisin içeren 1.5 mL'lik bir tüp, 4 mL 1x PBS'li 5 mL'lik bir tüp ve hücrelerin sabitlenmesi için buzlu bir kutu hazırlayın.
- İlgili inkübasyon süresi boyunca hücrelerin uyarılmasından sonra, 32.4 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve 1 μM iyonomisin ekleyerek hücreleri uyarın. Daha sonra hücreleri 37 ° C'de 16 saat ve% 5 CO2 tüpün kapağı açıkken inkübe edin (kontaminasyonu önlemek için, hava geçirgen bir sızdırmazlık filmi kullanılabilir, 5 mL tüpleri 5 dakika boyunca 200 x g'de döndürün ve hücreleri 5 mL tüplerde 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
- Hücrelere 340 μM formaldehit (13.5 μL %37 formaldehit) ekleyin. Dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek kısa bir karıştırma işleminden sonra, süspansiyonu oda sıcaklığında 2,5 dakika (Jurkat hücreleri) veya 5 dakika (hasta örneği) inkübe edin.
not: Primer hücrelerin optimal kesmeyi sağlaması için uzun fiksasyon süresi gereklidir.
- Fiksasyonu durdurmak için 125 mM glisin (57 μL 1.25 M glisin) ekleyin ve 5 dakika daha inkübe edin. Hücreleri hemen ardından buzun üzerine koyun ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyon ile çıkarın.
- Hücreleri 1 mL buz gibi PBS ile 200 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın ve süpernatanı her seferinde aspirasyonla çıkarın.
not: Sabitlemeden sonra protokol duraklatılabilir. Sabit hücreler -80 °C'de saklanmalıdır. Test etmek için, aşağıdaki protokolde kullanılması amaçlanan antikorun epitopu fiksasyon yoluyla maskelenmezse, SDS-PAGE jel elektroforezi ve Western blot yoluyla analiz için ek numuneler kullanılabilir. Bu adımlar, üreticinin talimatlarına göre 100 μg protein ile gerçekleştirilir. Tüm αNFAT2 antikorları 1:1000'lik bir seyreltmede, GAPDH antikoru 1:10000'lik bir seyreltmede kullanılır. Uygun ve uygun olmayan antikorlara sahip Jurkat hücrelerinden alınan sabit örneklerin örnek bir görüntüsü Şekil 1'de gösterilmiştir.
- Hücre peletini, ticari olarak temin edilebilen lizis tamponu 1'in 5 mL'sinde yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Ardından, numuneleri bir çalkalayıcı üzerindeki buzun üzerine yerleştirin ve çalkalarken 10 dakika inkübe edin.
not: Lizizden önce, hücreler sıvı nitrojen içinde 10 saniye boyunca parçalanabilir. Bu, Jurkat hücreleri için yararlıdır, ancak birincil hasta örneklerinde kaçınılmalıdır. Parçalanma için 5 mL'lik tüpleri 5 saniye boyunca belirli bir kapta 5-10 mL sıvı nitrojen içine yerleştirin. Koruyucu gözlük ve uygun koruyucu eldiven kullanın.
- Daha sonra, tüpleri 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın.
- Hücreleri, ticari olarak temin edilebilen 5 mL lizis tamponu 2'de yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin ve çalkalarken buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra tüpleri 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın.
- Hücre peletini 500 μL (Jurkat hücreleri) veya 140 μL (hasta örnekleri) 1x proteaz inhibitörü (sırasıyla 5 μL veya 1.4 μL) içeren kesme tamponu 1'de yeniden süspanse edin ve karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- Kromatin kesme için, 1.9. adımdan 140 μL hücre süspansiyonunu sonikatör tüplerine aktarın (hava kabarcıkları üretmekten kaçının ve numune hacmi nedeniyle gerekirse bu adımı tekrarlayın). Tüpleri odaklanmış ultrasonik cihaza 7 ° C sıcaklıkta yerleştirin ve 10-7.5 bp DNA parçaları elde etmek için ortalama 9.375 W olay gücüyle 200 dakika (hücre hattı) veya 500 dakika (hasta örnekleri) kesin.
- Son olarak, küçük santrifüjde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15700 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mL tüpte toplayın.
- Uygun parça boyutlarını test etmek için, %1.5 TBE agaroz jel içinde jel elektroforezi yoluyla 20 μL'lik kesilmiş kromatini analiz edin. İyi ve kötü kalitedeki Jurkat hücrelerinden kesilmiş kromatinin örnek bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu noktada, protokol potansiyel olarak duraklatılabilir. Kesilmiş kromatin -80 °C'de saklanmalıdır.
