Kromatin İmmünopresipitasyon Deneyi: Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Fuchs, A. R.,et al. Kronik Lenfositik Lösemide Yeni NFAT2 Hedef Genlerini Tanımlamak İçin Bir Kromatin İmmünopresipitasyon Testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, protein-DNA etkileşimlerini göstermek için klasik bir teknik olan kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi için protokolü açıklar. Bu teknik, insan kronik lenfositik lösemi hücrelerindeki hedef genleri tanımlamak için kullanılır.

Protokol

1. Kromatin İmmünopresipitasyonu

NOT: Kromatin immünopresipitasyonu, üreticinin talimatlarına göre modifikasyonlarla birlikte ticari olarak temin edilebilen bir ChIP kiti ile gerçekleştirilmiştir.

1. İmmünopresipitasyon sayısını hesaplayın (70 μL (Jurkat hücreleri) veya 15 μL (hasta örnekleri) kesilmiş kromatin artı bir antikor) ve 1.5 mL'lik bir tüpte çökeltme başına 20 μL protein A kaplı boncuk hazırlayın. Boncukları her yağışta 40 μL 1x ChIP tamponunda 1 yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın, boncukları manyetik bir rafta 1 dakika dinlendirin ve pipetleme ile süpernatanı çıkarın. Bu adımı toplam dört kez gerçekleştirin. Sonunda, orijinal birimdeki boncukları 1x ChIP tamponu 1 ile yeniden askıya alın.
2. İmmünopresipitasyonun kendisi için, NFAT2'yi bağlı hedef dizileriyle yakalamak için 10 μg αNFAT2 antikoru (7A6) kullanın. IgG kontrolü olarak 2.5 μg tavşan IgG antikoru (DA1E) kullanın. Reaksiyonları Tablo 1.
   'de belirtildiği gibi taze 1.5 mL tüplerde hazırlayın NOT: Bu protokol için fiksasyon sırasında epitopu maskelenmemiş, yüksek afiniteye sahip bir monoklonal antikor kullanılması önemlidir. Poliklonal antikorlar, alınan sonuçların uygun şekilde yorumlanmasını önemli ölçüde zorlaştıran ek bir varyasyon seviyesi sunar.
3. Karışımı adım 1.2'den itibaren gece boyunca 4 °C'de 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
4. Ertesi gün, tüpleri küçük santrifüjde 7.000 x g'da 5 saniye döndürün, manyetik bir rafta 1 dakika inkübe edin ve süpernatanı aspirasyonla çıkarın. Boncukları 1, 2, 3 ve 4 numaralı yıkama tamponlarının her biri ile art arda bir kez yıkayın.
5. Bunu yapmak için, boncukları 350 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
6. Daha sonra, tüpleri küçük santrifüjde 7000 x g'da 5 saniye döndürün. Ardından, 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyun, süpernatanı çıkarın ve bir sonraki yıkama tamponunu ekleyin.
7. Son yıkama adımından sonra, süpernatanı pipetleyerek çıkarın, boncukları 100 μL elüsyon tamponu 1 içinde alın ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakika inkübe edin.
8. Tüpleri kısa bir süre döndürün (küçük santrifüjde 7000 x g'da 5 sn) ve 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyun.
9. Daha sonra süpernatanı pipetleyerek yeni bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın ve 4 μL elüsyon tamponu 2 ekleyin.
10. Giriş kontrolünü oluşturmak için, 1 μL kesilmiş kromatini 99 μL elüsyon tamponu 1 ve 4 μL elüsyon tamponu 2 ile karıştırın (bu kurulumda, hasta başına üç tüp vardır: bir giriş kontrolü, bir IgG kontrolü ve bir αNFAT2 örneği).
11. Numuneleri 1,5 mL'lik bir tüp çalkalayıcıda 65 ° C'de ve 1300 rpm'de 4 saat inkübe edin. 100 μL %100 izopropanol ekleyin, girdap yapın ve numuneleri küçük santrifüjde 7000 x g'da 5 saniye döndürün.
12. Mevcut manyetik boncukları iyice girdaplayarak yeniden süspanse edin, her numuneye 10 μL boncuk ekleyin ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
13. İnkübasyondan sonra, tüpleri küçük santrifüjde 7000 x g'da 5 saniye döndürün ve 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatanı aspirasyon ile çıkarın.
14. Boncukları 100 μL yıkama tamponu 1 içinde yeniden süspanse edin. Karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve oda sıcaklığında 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 5 dakika inkübe edin.
15. Tüpleri küçük santrifüjde 7000 x g'da 5 saniye döndürün, manyetik bir rafa 1 dakika koyun ve süpernatanı pipetleyerek çıkarın. 2.13-2.14 adımlarını yıkama tamponu 2 ile tekrarlayın.
16. Daha sonra, yıkama tamponunu aspirasyon ile çıkarın, boncukları 55 μL elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin ve çökelmiş DNA'yı elüte etmek için 6 rpm'de dönen tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, tüpleri küçük santrifüjde 7000 x g'da 5 saniye döndürün, manyetik bir rafa 1 dakika koyun ve süpernatanı yeni 1,5 mL tüplere aktarın.
    not: Burada protokol potansiyel olarak duraklatılabilir. Ayrıştırılan DNA daha sonra -20 °C'de saklanmalıdır.

madde	IP başına hacim (μL)
%5 BSA	6
100 x proteaz inhibitörü	3
5 x ChIP tamponu 1	56
kesilmiş kromatin	x (15 μL veya 70 μL)
Protein A kaplı manyetik boncuklar	20
ChIP sıralı sınıf su	185-XY
antikor (αNFAT2 veya IgG kontrolü)	y (1,09 μL veya 1 μL)
toplam	270

Tablo 1: Kromatin immünopresipitasyonunun pipetlenmesi için program. Kromatin immünopresipitasyonu, tabloda belirtildiği gibi reaksiyonların hazırlanmasıyla gerçekleştirildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-NFAT2 antikoru	İsmail	1008505	Klon 7A6
Anti-NFAT2 antikoru	Hücre Sinyalizasyonu	8032S Serisi	Klon D15F1
Anti-NFAT2 antikoru ChIP Sınıfı	Abcam Belediyesi	ab2796	Klon 7A6
Manyetik raf, DynaMag-15 Mıknatıs	Termo Bilimsel	12301D	Benzer aletlerle ikame edilebilir
Histonlar için iDeal ChIp-seq kiti	Diagenode (Şeker Düğümü)	C01010059
Küçük Santrifüj	Termo Bilimsel	Heraeus Fresk 17	Benzer aletlerle ikame edilebilir
Çalkalayıcı Duomax 1030	Heidolph Aletleri	543-32205-00	Benzer aletlerle ikame edilebilir
Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Kokteyli (100X)	Termo Bilimsel	78440
IRDye 680LT Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L), 0.5 mg	LI-COR Biyolojik Bilimler	926-68023
IRDye 800CW Keçi Anti-Fare IgG (H + L), 0.1 mg	LI-COR Biyolojik Bilimler	925-32210
DNA Bağlanma Tüpü 1.5 mL	Eppendorf	22431021
FBS üstün	Merck	S0615 Serisi
%37 Formaldehit pa, ACS	Roth	4979.1
1 adet PBS	Sigma Aldrich	D8537
M220 Fokuslu ultrasonikatör	Covaris (Türkçe)	500295
20X Bolt MES SDS Çalıştırma Tamponu	Termo Bilimsel	B0002
Tris Tamponlu Tuzlu Su (TBS-10X)	Hücre Sinyalizasyonu	#12498
iBlot 2 Jel Transfer Cihazı	Termo Bilimsel	IB21001
iBlot 2 Transfer Yığınları, nitroselüloz, normal boyut	Termo Bilimsel	B23001
büyük Santrifüj	Eppendorf Belediyesi	5804R	Benzer aletlerle ikame edilebilir

(İngilizce) Belediyesi · Serisi Serisi Serisi