HSPC Klonlarının Kültürlenmesi ve Hasat Edilmesi: Tek Başına Sıralanmış HSPC Klonlarını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Huber, A. R., et al. İnsan Kanının Mutasyon Yükünü ve Klonal Bileşimini Karakterize Etme. J. Vis. Exp. (2019).

Bu videoda, HSPC'leri kemik iliğinden izole etmek ve bunları tek tek sıralanmış HSPC'leri elde etmek için bir yöntem olan floresan aktive hücre sıralama tekniği kullanarak sıralama protokolü açıklanmaktadır. HSPC klonlarını elde etmek için bu sıralanmış hücreleri kültüre ediyoruz.

Protokol

1. HSPC İzolasyonu, Sıralama ve Kültür

1. 350 x g'da 5 dakika boyunca 1-2 x 10⁷ mononükleer hücrede döndürün ve 50 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre peletini 100 μL anti-CD3 boyama solüsyonunda (FACS tamponunda anti-CD antikorunun 1:100 seyreltilmesi) yeniden süspanse uğratın. Hücreleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: >2 x 10⁷ hücreli sıralama yaparken, antikor karışımını ve FACS tampon hacimlerini buna göre artırın.
2. Tablo 1'de görülen tarife göre 50 μL 2x HSC boyama karışımı hazırlayın
3. 50 μL hücre çözeltisini hazırlanan HSC boyama karışımı ile karıştırın ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika veya antikorların bağlanması için buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
4. 1 mL FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 350 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek pelet yapın.
5. Hücreleri 300 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasından (FACS) önce hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 35 μm hücre süzgeci kapaklı 5 mL polistiren tüpten süzün.
6. 100 ng / mL SCF, 100 ng / mL Flt3, 50 ng / mL TPO, 10 ng / mL IL-3, 20 ng / mL IL-6 ve 100 ng / mL antibiyotik formülasyonu ile desteklenmiş 1x SFEM ortamından oluşan 25 mL HSPC kültür ortamı hazırlayın (bkz.
7. 384 oyuklu bir hücre kültürü plakasını her kuyucukta 75 μL HSPC kültür ortamı ile doldurun.
   NOT: Dış kuyucuklardaki ortamın buharlaşmasını önlemek için, dış kuyucukları 75 μL steril su veya PBS ile doldurun ve bu kuyucukları hücre sınıflandırması için kullanmayın.
8. Tek HSPC'leri sıralama
   1. Lekelenmemiş bir kontrole (tek tek sıralanmış HSC'ler) ve lekeli numuneden 10.000 hücreye dayalı olarak HSPC sıralaması için kapıları ayarlayın. Kapıların ayarlanması için temsili bir sonuç Şekil 1'de gösterilmiştir. Doğrusal FSC yüksekliği ve FSC alan fraksiyonu etrafında bir geçit çizerek tek hücreleri kapılayın. Soy ^fraksiyonu için kapı çizmek için boyanmamış kontrol fraksiyonu kullanın. CD34⁺ hücreleri için kapılar çizin ve CD38^- CD45RA^- hücreleri için özel bir kapı ayarlayarak bu alt kümeyi daha fazla karakterize edin.
   2. 384 kuyulu plakayı FACS makinesine yükleyin ve tek hücreleri sıralayın.
      NOT: FACS makinesi için geçerliyse, sıralanan hücrelerin yeniden izlenmesini sağlamak için dizin sıralama verilerini tutma seçeneğini açın.
9. Tek tek sıralanmış HSC'lerin kültürlenmesi
   1. 384 kuyulu plakayı doğrudan %5 CO₂.
      içeren nemlendirilmiş 37 °C inkübatöre aktarın not: Kültür sırasında buharlaşmayı önlemek için, 384 kuyulu kültür plakasını (kapaklı) şeffaf polietilen sargıya sarın.
   2. 384 oyuklu plakayı, görünür klonlar görünene kadar 3-4 hafta inkübatörde tutun. Klonal kültürün temsili görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Giriş malzemesinin durumuna bağlı olarak, sıralanan hücrelerin %5-30'u klonal olarak genişleyecektir.

Serisi Serisi Serisi Serisi

antikor	hacim [μL]
BV421-CD34	5
FITC-Soy karışımı (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	2
APC- CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE / CY7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
FACS Tamponu	25,5

Tablo 1: HSC sıralama karışımı.Gösterilen, HSC'leri sıralamak için kullanılan antikorların seyreltilmelerini gösteren bir tablodur.

2. HSPC Klonlarını Hasat Etme

1. 4 haftalık kültürlemeden sonra, hangi kuyuların% 30 veya daha yüksek bir birleşme oranına sahip olduğunu belirleyin.
2. PBS'de 1.5 mL mikrotüpleri 1 mL% 1 BSA ile önceden doldurun (her klonal büyüme için) ve tüpü ilgili kuyucuğa göre etiketleyin.
3. Pipet ucuna yapışan hücre sayısını en aza indirmek için pipet ucunu PBS'de %1 BSA ile önceden ıslatın.
4. 200 μL'lik bir pipet (75 μL'ye ayarlanmış) ile kuyudaki ortamı şiddetli bir şekilde (en az 5 kez) yukarı/aşağı pipetleyin ve kuyudaki hücreleri gevşetmek için kuyunun dibini kazıyın ve hücre süspansiyonunu kuyuya karşılık gelen etiketli mikrotüpte toplayın.
5. PBS'de 75 μL taze %1 BSA alın ve maksimum hücre alımını sağlamak için kuyuda pipetlemeyi tekrarlayın.
   NOT: Klonal olarak kültürlenmiş hücreler kuyu dibine yapışabilir. Tüm hücrelerin toplanıp toplanmadığından emin olmak için standart bir ters çevrilmiş ışık mikroskobu kullanarak kuyuları inceleyin.
6. %>30 birleşime sahip tüm kuyucuklar hasat edilmişse, 384 kuyu plakasını tekrar inkübatöre yerleştirin. Klonal kültürler 5 haftaya kadar çoğalabilir.
7. Hücre süspansiyonunu 350 x g'da 5 dakika aşağı döndürün. Küçük bir pelet görünür olmalıdır.
8. Yaklaşık 5 μL süpernatan hariç hepsini dikkatlice çıkarın. Hücre peletleri -20 °C'de dondurulabilir ve DNA izolasyonundan önce birkaç ay saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Girdi materyaline dayalı deneysel prosedürü gösteren akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hücre...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CD11c FITC	Biyo Efsane	301603	Klon 3.9
CD16 FITC Serisi	Biyo Efsane	302005	Klon 3G8
CD3 BV650	Biyo Efsane	300467	UCHT1'i klonlayın
CD34 Serisi BV421	Biyo Efsane	343609	561
CD38 PE	Biyo Efsane	303505	HIT2'yi klonlayın
CD45RA PerCP / Cy5.5	Biyo Efsane	304121	HI100'ü klonlayın
CD49f PE / CY7	Biyo Efsane	313621	GoH3'ü klonlayın
CD90 APC	Biyo Efsane	328113	Klon 5E10
Hücre Süzgeci 5 mL tüp	Corning	352235
CELLSTAR plakası, 384w, 130 μL, F alt, TC, kapak	Greiner	781182
İnsan Flt3-Ligand, birinci sınıf	Miltenyi Biyoteknoloji	130-096-479	PBS'de% 0.1 BSA'da 100 μg / mL'de tek kullanımlık alikotlarda (25 μL) rekonsitasyon
İnsan Rekombinant IL-3 (E. coli eksprese edilmiş)	Kök Hücre Teknolojileri	78040.1	PBS'de% 0.1 BSA'da 100 μg / mL'de tek kullanımlık alikotlarda (2.5 μL) rekonsitasyon
İnsan Rekombinant IL-6 (E. coliexpressed)	Kök Hücre Teknolojileri	78050.1	PBS'de% 0.1 BSA'da 100 μg / mL'de tek kullanımlık alikotlarda (5 μL) rekonsitasyon
İnsan SCF, birinci sınıf	Miltenyi Biyoteknoloji	130-096-695	PBS'de% 0.1 BSA'da 100 μg / mL'de tek kullanımlık alikotlarda (25 μL) rekonsitasyon
İnsan TPO, birinci sınıf	Miltenyi Biyoteknoloji	130-095-752	PBS'de% 0.1 BSA'da 100 μg / mL'de tek kullanımlık alikotlarda (12.5 μL) rekonsitasyon
Köken (CD3/14/19/20/56) FITC	Biyo Efsane	348701	Klonlar: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Enstitünün tesisinde yapılmıştır. Ticari olarak mevcut PBS de kullanılabilir
Çuha çiçeği	Canlılık	KARINCA PM-1	Antibiyotik formülasyonu

Serisi Serisi (İngilizce) Bellek Kartı