$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
c-Kit+ Hücrelerinin Kemik İliğinden İzolasyonu
- Fareleri kurumsal yönergelere göre kurban edin.
NOT: Burada, fareler, solunum ve kalp atışının durması ve ardından servikal çıkık ile ölüm belirlenene kadar AVMA tarafından önerilen akış hızına göre karbondioksite (CO2) maruz bırakıldı.
- Fareden bacak kemiklerini toplayın - iki uyluk kemiği, iki tibia, iki iliak. Bir neşter ile kazıyarak kemiklerdeki tüm dokuları temizleyin. Bacak kemiklerini soğuk 1x PBS'ye koyun - 15 mL'lik bir tüpte 5 mL. Tüpün içeriğini bir harç içine dökün ve bir havaneli ile ezin.
- Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek, bir pipet kullanarak 10 mL'lik bir pipet takılı 50 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe süzün. Harcı ve havaneli soğuk 1x PBS ile defalarca yıkayın, toplayın ve 50 mL'lik tüpe hücre süspansiyonu ekleyin. Kemik iliğini 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1.200 x g'da döndürün. Süpernatanı, bir cam pipet takılı bir vakumla çıkarın. Hücre peletini bir pipetle 5 mL 1x PBS'de askıya alın.
- Bir pipetle, arayüzü bozmamaya büyük özen göstererek, 5 mL oda sıcaklığında (sıcaklık kritiktir) polisikarozun üstüne yavaşça asılı kemik iliği ekleyin. Fren kapalıyken oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
- Bulanık toplam mono-nükleer hücre (TMNC) arayüzünü bir pipetle toplayın ve 15 mL'lik yeni bir tüpe koyun. Yıkama için 1x PBS ile hacmi 10 mL'ye getirin, saymak için 20 μL alın ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1.200 x g'de döndürün. Süpernatanı atın ve peleti adım 4.6.1 için buz üzerinde saklayın.
- c-Kit+ hücre izolasyonu gerçekleştirin.
- c-Kit+ hücre izolasyonu için bir mikroboncuk kiti protokolünü izleyin. Hücre peletini 80 μL 1x PBS + EDTA + BSA'da 107 hücreye yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 20 μL CD117 MicroBeads / 107 toplam hücre ekleyin. Girdaplama yaparak iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin. 1x PBS + EDTA + BSA ekleyerek hacmi 10 mL'ye getirin ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1.200 x g'da döndürün.
- Süpernatanı bir vakum yoluyla çıkarın ve hücre peletini 1x PBS + EDTA + BSA'da 500 μL /10 8 toplam hücrede askıya alın. Manyetik sütun takılıyken mıknatıs standını kullanarak, 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA ekleyin ve yerçekimi yoluyla 15 mL'lik bir toplama tüpüne akmasına izin verin.
- İlk tampon ilavesi kolondan geçmeyi bitirdiğinde, hücre süspansiyonunu kolona ekleyin ve yerçekimi yoluyla 15 mL toplama tüpüne akmasına izin verin. Bu akış, istenmeyen hücre fraksiyonudur.
- Kolonu her seferinde 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA ile 3 kez yıkayın ve yerçekimi yoluyla toplama tüpüne akmasına izin verin. Sütunu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpün üstüne yerleştirin.
- 5 mL 1x PBS + EDTA + BSA ekleyin ve hemen kolonla birlikte verilen piston ile yıkayın. Pistonu çıkarın ve ek 5 mL 1x PBS + EDTA + BSA ile yıkamayı tekrarlayın. Standart yöntemleri kullanarak toplam hacimdeki hücreleri sayın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1.200 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın ve peleti tam IMDM'de (IMDM +% 10 FBS + IL-6 [10 ng / mL] + mSCF [50 ng / mL] + FLT3 ligandı [20 ng / mL] + IL-3 [10 ng / mL]) kültür için. Bu hücreleri gece boyunca 2 x 106 hücre / 1 mL hücre IMDM tam ortamında 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirerek kültürleyin.