Retroviral Aracılı Transdüksiyon: Hedef Geni Kanser Hücrelerine Sokmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kesarwani, M., et al. Onkogen Bağımlılığında c-Fos ve Dusp1'in Rolünü Değerlendirme Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, kronik miyeloid lösemi hücre hatlarında retrovirüsler kullanarak hedef genleri transfer ederek genetik doğrulama protokolünü açıklar. Retrovirüsler, hedef genin uzun süreli ekspresyonunu sağlayan transdüksiyon adı verilen süreçle genetik materyali lösemi hücresine aktarmak için bir aracı görevi görür. Bu yöntem, genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için herhangi bir hedef hücreye uygulanabilir.

Protokol

1. İletim

1. Retroviral plazmit transfeksiyonu
   1. HEK293 hücrelerini öğleden sonra 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda taze olarak çözdürün. HEK hücrelerini içeren kriyotüpü oda sıcaklığında 435 x g'da 3 dakika döndürün. Süpernatanı bir vakum yoluyla çıkarın ve hücre peletini %10 FBS, penisilin, streptomisin ve glutamin ile desteklenmiş 1 mL DMEM içinde askıya alın.
   2. Hücreleri sayın ve uygun hacmi 10 cm'lik işlenmiş bir kaba (~ 4 x 10⁶ HEK293T hücre) ekleyin. Tabağa 14 mL DMEM 10 besiyeri ekleyin ve eşit bir dağılım için yukarı ve aşağı kaydırarak iyice karıştırın. Çanağı gece boyunca 37 °C, %5 CO₂ inkübatöre koyun.
   3. Ertesi sabah, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında hücrelerin birleşip birleşmediğini kontrol edin (% 50 veya daha fazlası iyi çalışır).
   4. DNA (istenen retroviral plazmit), PclEco (ambalaj plazmidi), 2 M CaCl₂ ve H₂0'ı 1.5 mL'lik bir tüpte (= 500 μL) aşağıdaki miktarlarda bir mikropipet kullanarak birleştirin: 7.5 μg DNA (BCR-ABL1-YFP), 7.5 μg pCLeco, 62 μL 2 M_CaCl2 ve 500 μL'lik bir nihai hacme kadar su. Başka bir 1.5 mL tüpe 500 μL 2x HBS ekleyin.
   5. Karıştırma sırasında DNA karışımını 500 μL 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES ve 1.5 mM Na₂HPO₄) içeren 1.5 mL tüpe damla damla ekleyin. Bunu, bir girdabı en düşük hıza ayarlayarak ve transfeksiyon karışımını eklerken sürekli karıştırma için HBS tüpünü üzerinde tutarak elde edin.
   6. Transfeksiyon karışımının oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilmesine izin verin. İnkübasyon sırasında, HEK hücrelerine 25 nM klorokin ekleyin ve bunları tekrar inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, transfeksiyon karışımını HEK hücrelerine damla damla ekleyin ve ardından, transfeksiyon karışımını plaka boyunca karıştırmak için ortamı hafifçe döndürün.
   7. Hücreleri karışımla birlikte 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde ~ 8 saat inkübe edin. 14 mL taze DMEM 10 besiyerini çok yavaş bir şekilde ekleyerek bu hücrelerdeki besiyerini değiştirin. Tabağın duvarına yavaşça pipetlemek, HEK hücrelerinin herhangi bir şekilde sıyrılmasını önlemeye yardımcı olur. Hücreleri gece boyunca 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
   8. Viral süpernatanı 10 mL'lik bir şırınga ile toplayın, süpernatanı şırıngaya çekin ve 0.45 μm şırınga filtresini takın. Viral süpernatanı yeni bir toplama tüpüne daldırın. İlk viral süpernatant koleksiyonunu ~ 16 saat sonra alın.
2. Fibronektin viral konsantrasyonu ve iletimi
   1. İşlenmemiş 6 oyuklu kültür plakalarına 1x PBS'de 2 mL 0.1 mg rekombinant insan fibronektin fragmanı ekleyin. Hücre sayısına ve genotiplere bağlı olarak gerektiği kadar fibronektin hazırlayın. Bir kuyu, 10 milyon c-Kit+ hücresini yeterince dönüştürebilir. Plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   2. Ertesi gün, fibronektini bir pipetle oyuklardan çıkarın, plakayı bloke etmek için 1x PBS'de 2 mL steril% 2 BSA pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. BSA'yı bir vakumla çıkarın ve 2 mL 1x PBS pipetleyerek iyice yıkayın, ardından bir vakumla çıkarın.
   3. Hemen 5 mL'ye kadar taze toplanmış ve filtrelenmiş (0.45 μm'de) viral süpernatan ekleyin. 435 x g'da 32 °C'de 2 saat santrifüjleyin. Süpernatanı bir vakumla çıkarın ve bu adımı yeni toplanmış viral süpernatan ile tekrarlayın ve tekrar döndürün. Süpernatanı bir vakumla çıkarın ve 2 mL 1x PBS ekleyerek kuyuları yıkayın; Ardından, bir vakumla çıkarın.
   4. Hücreleri aşağı döndürerek ve peleti kültür için tam IMDM'de yeniden süspanse ederek gece boyunca kültürlenen c-Kit + fare hücrelerini ekleyin. Bu hücreleri gece boyunca 2 x 10⁶ hücre / 1 mL hücre IMDM tam ortamında 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre yerleştirerek viral kaplı kuyucuklara kültür edin, hücre süspansiyonlarını iyice karıştırarak ve bunları şimdi viral konsantre fibronektin plakasına pipetleyerek. 90 dakika boyunca 25 ° C'de 1.200 x g'da döndürün. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatöre koyun.
   5. Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1.200 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve FACS tamponu #1'de (1x PBS +% 0.5 BSA) 6 x 10⁶ / mL'ye yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi kullanarak YFP pozitif yüzdesini ölçerek BCR-ABL1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.
   6. Standart prosedürle olayları alın. İlk olarak, canlı hücreleri ileri ve yan saçılmaya dayalı olarak geçitleyin. Ardından, negatif kontrol ile belirlenen YFP-negatif hücreleri hariç tutan YFP pozitif canlı hücreleri kapatın (Şekil 1).

Sonuçlar

Şekil 1: Nakledilen bir farenin ve bir WT faresinin kanından YFP + hücrelerinin sıklığını gösteren FACS (negatif kontrol). Üst paneller, hücrelerin ve kapının dağılım grafiğini gösterir. Alt paneller, YFP ve yan saçılma histogramlarını gösterir. MFI'si >10³ olan hücreler YFP + olarak kabul edildi. Transdüksiyon yüzdesini hesaplamak için...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM (Ömer Çiçeğ	Cellgro (corning)	15-013-Özgeçmiş
RetroNectin Rekombinant İnsan Fibronektin Fragmanı	Takara	T100B
FBS (FBS)	Atlanta biyolojik	S11150 Serisi
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-Glutamin	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL su stoğu
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H7006
Pbs	Corning	21040Özgeçmiş
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390 Serisi
Kalsiyum Klorür	Canlandırıcı	K278001
2 adet HBS	Canlandırıcı	K278002
Edta	Ambion Teknolojisi	AM9261
Bsa	Sigma	A7906
İnsan Uzun Süreli Kültür Başlatıcı Hücre Testi	Stemp Hücre Teknolojileri
TC-10 otomatik hücre sayacı	Biyo-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Evde yapılan
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Evde yapılan
ROSACreERT2	Jackson Laboratuvarı
C57Bl/6	Jackson Laboratuvarı
CML-CD34+ ve Normal CD34+ hücreleri	Üniversite Hastanesi, Cincinnati Üniversitesi
LSR II (FACS analizörü)	Bd
Fortessa I (FACS analizörü)	Bd
FACSAriaII (FACS Sıralayıcı)	Bd
NAPCO serisi 8000 WJ CO2 inkübatörü	Termo bilimsel
Salıncak kovası rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf Belediyesi
1/2 cc Lo-Dose u-100 insülin şırıngası 28 G1/2	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.
Hidrokortizon Sodyum Hemisüksinat	Kök Hücre Teknolojileri	7904
GM-CSF (Genel Müdür)	Prospec (Önerme	CYT-221 Serisi
G-SCF (Güneydoğu)	Prospec (Önerme	CYT-220 Serisi
İnsan IL-3	Prospec (Önerme	CYT-210 Serisi
insan SCF'si	Prospec (Önerme	CYT-255 Serisi
Eritropoiein	Amgen (Türkçe)	5513-267-10
BD Perm/Wash (fosfo akışı için geçirgenleştirme ve yıkama solüsyonu)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (Sabitleme ve geçirgenlik çözümü)	Bd	554714
BD Eczane Lyse	Bd	555899
70 μm naylon hücreli stariner	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	352350
0,45 μM akro disk filtre	Polat	Sezonu 2016-10

Serisi Serisi Serisi Serisi ) ) ) )