Retroviral Aracılı Transdüksiyon: Hedef Geni Kanser Hücrelerine Sokmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kesarwani, M., et al. Onkogen Bağımlılığında c-Fos ve Dusp1'in Rolünü Değerlendirme Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, kronik miyeloid lösemi hücre hatlarında retrovirüsler kullanarak hedef genleri transfer ederek genetik doğrulama protokolünü açıklar. Retrovirüsler, hedef genin uzun süreli ekspresyonunu sağlayan transdüksiyon adı verilen süreçle genetik materyali lösemi hücresine aktarmak için bir aracı görevi görür. Bu yöntem, genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için herhangi bir hedef hücreye uygulanabilir.

Protokol

1. İletim

1. Retroviral plazmit transfeksiyonu
   1. HEK293 hücrelerini öğleden sonra 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda taze olarak çözdürün. HEK hücrelerini içeren kriyotüpü oda sıcaklığında 435 x g'da 3 dakika döndürün. Süpernatanı bir vakum yoluyla çıkarın ve hücre peletini %10 FBS, penisilin, streptomisin ve glutamin ile desteklenmiş 1 mL DMEM içinde askıya alın.
   2. Hücreleri sayın ve uygun hacmi 10 cm'lik işlenmiş bir kaba (~ 4 x 10⁶ HEK293T hücre) ekleyin. Tabağa 14 mL DMEM 10 besiyeri ekleyin ve eşit bir dağılım için yukarı ve aşağı kaydırarak iyice karıştırın. Çanağı gece....

Sonuçlar

Şekil 1: Nakledilen bir farenin ve bir WT faresinin kanından YFP + hücrelerinin sıklığını gösteren FACS (negatif kontrol). Üst paneller, hücrelerin ve kapının dağılım grafiğini gösterir. Alt paneller, YFP ve yan saçılma histogramlarını gösterir. MFI'si >10³ olan hücreler YFP + olarak kabul edildi. Transdüksiyon yüzdesini hesaplamak için.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM (Ömer Çiçeğ	Cellgro (corning)	15-013-Özgeçmiş
RetroNectin Rekombinant İnsan Fibronektin Fragmanı	Takara	T100B
FBS (FBS)	Atlanta biyolojik	S11150 Serisi
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-Glutamin	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL su stoğu
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H7006
Pbs	Corning	21040Özgeçmiş
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390 Serisi
Kalsiyum Klorür	Canlandırıcı	K278001
2 adet HBS	Canlandırıcı	K278002
Edta	Ambion Teknolojisi	AM9261
Bsa	Sigma	A7906
İnsan Uzun Süreli Kültür Başlatıcı Hücre Testi	Stemp Hücre Teknolojileri
TC-10 otomatik hücre sayacı	Biyo-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Evde yapılan
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Evde yapılan
ROSACreERT2	Jackson Laboratuvarı
C57Bl/6	Jackson Laboratuvarı
CML-CD34+ ve Normal CD34+ hücreleri	Üniversite Hastanesi, Cincinnati Üniversitesi
LSR II (FACS analizörü)	Bd
Fortessa I (FACS analizörü)	Bd
FACSAriaII (FACS Sıralayıcı)	Bd
NAPCO serisi 8000 WJ CO2 inkübatörü	Termo bilimsel
Salıncak kovası rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf Belediyesi
1/2 cc Lo-Dose u-100 insülin şırıngası 28 G1/2	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.
Hidrokortizon Sodyum Hemisüksinat	Kök Hücre Teknolojileri	7904
GM-CSF (Genel Müdür)	Prospec (Önerme	CYT-221 Serisi
G-SCF (Güneydoğu)	Prospec (Önerme	CYT-220 Serisi
İnsan IL-3	Prospec (Önerme	CYT-210 Serisi
insan SCF'si	Prospec (Önerme	CYT-255 Serisi
Eritropoiein	Amgen (Türkçe)	5513-267-10
BD Perm/Wash (fosfo akışı için geçirgenleştirme ve yıkama solüsyonu)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (Sabitleme ve geçirgenlik çözümü)	Bd	554714
BD Eczane Lyse	Bd	555899
70 μm naylon hücreli stariner	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	352350
0,45 μM akro disk filtre	Polat	Sezonu 2016-10

Serisi Serisi Serisi Serisi ) ) ) )