Metil Selüloz Bazlı CFU Testi: Lösemik Hücrelerde Anti-kanser Bileşiklerinin Koloni Oluşumu Üzerindeki Etkisini Belirlemeye Yönelik Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kesarwani, M., et al. Onkogen Bağımlılığında c-Fos ve Dusp1'in Rolünü Değerlendirme Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, antikanser bileşiklerle tedaviye yanıt olarak lösemik hücreler tarafından oluşturulan kolonilerin sayısını tanımlamaya ve saymaya yardımcı olan metil selüloz bazlı koloni oluşum birimi veya CFU testi protokolünü açıklar.

Protokol

1. Koloni Oluşturan Birim Tahlilleri

1. Metilselülozu fare için sitokinlerle oda sıcaklığında 1-2 saat çözdürün. İğnesiz 5 mL'lik bir şırınga kullanarak bir FACS tüpünde 3 mL metilselülozu alikot edin. YFP pozitif hücreleri bir hücre sıralayıcıda sıralayın.
2. Hücreleri döndürün ve peleti IMDM tam ortamında askıya alın. Kaplanacak hücreleri sayın ve 100 μL IMDM tam ortamında 5.000 YFP pozitif hücre elde etmek için seyreltin.
3. 5.000 YFP pozitif hücre ve uygun inhibitörleri içeren 100 μL hücre süspansiyonunu 3 mL metilselüloza ekleyin. 10-30 saniye karıştırmak için yüksekte girdap.
4. Hava kabarcıklarının çoğu kaçtıktan sonra, 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 1 mL medyayı üç adet 3 cm'lik plakada plakayı bir taraftan çıkararak ve plakayı eşit şekilde yaymak için dairesel hareketlerle yavaşça eğerek 3 cm'lik üç kopya halinde plakalayın.
5. Kullanılacak inhibitörlerin nihai konsantrasyonu, tek başına veya kombinasyonlar halinde 3 μM'de imatinib, 0.2 μM'de DFC ve 0.5 μM'de BCI'dir. Uygun olan her yerde, hücreleri metilselüloza eklenen 4-hidroksitamoksifen (1 μg / mL) ile kaplayarak c-Fos'u silin.
6. Kaplamadan sonra, plakaları ortasında 2 mL steril su içeren bir açık tabak bulunan büyük bir Petri kabına koyun. Büyük Petri kabının üzerini örtün ve 37 °C, %5_CO2 inkübatörde dikkatlice inkübe edin. Mikroskop altında toplam koloni sayısını sayarak bir haftalık kaplamadan sonra koloni sayılarını kaydedin.
7. PCR ile c-Fos delesyonu için uygun plakalardan birkaç koloniyi analiz edin. Kolonileri P1000 ucu ile emerek toplayın. PBS'deki ucu birkaç kez yıkayarak hücreleri 500 μL 1x PBS'de yerinden çıkarın. Hücre süspansiyonlarını 1 dakika boyunca 6.000 x g'da döndürün ve bir genomik DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı hücre peletinden çıkarın.
8. mFos-FP3 ve mFos-RP5 primerlerini kullanarak PCR için genomik DNA'yı kullanın. PCR ürünlerini %2'lik bir agaroz jel üzerinde analiz edin ve bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak görüntü elde edin.
9. Kolonilerin grafiksel bir sunumu için, İyodonitrotetrazolium klorür kullanarak kolonileri boyayın. 1 mg / mL'lik bir çözelti elde etmek için 10 mg İyodonitrotetrazolyum klorürü 10 mL suda çözün. Filtre, bir doku kültürü davlumbazında steril koşullar altında 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0.2 μm'lik bir filtreye sahip bir Luer kilidi kullanarak çözeltiyi sterilize edin.
10. Doku kültürü başlığında, CFU plakasının etrafına damla damla 100 μL boyama solüsyonu ekleyin; kolonileri kaydırmamaya veya rahatsız etmemeye dikkat edin. Plakaları gece boyunca 37 °C,% 5 CO₂ hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Koloniler koyu kırmızımsı kahverengiye döner. Steril doku kültürü başlığında beyaz bir arka plan kullanarak, lekeli CFU plakasının fotoğraflarını çekin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (Fare CFU için Metilselüloz)	Kök Hücre	3434
4-Hidroksitamoksifen	Sigma	H6278
Rekombinant Murin SCF	Prospec (Önerme	CYT-275 Serisi
Rekombinant Murin Flt3-Ligand	Prospec (Önerme	CYT-340 Serisi
Rekombinant Murin IL-6	Prospec (Önerme	CYT-350 Serisi
Rekombinant Murin IL-7	Peprotech teknolojisi	217-17
Dfc	LKT Laboratuvarlar A.Ş.	D3420
BCI (Mali İşler T	Chemzon Bilimsel	Yeni Zelanda-06-195
İmatinib	LC Laboratuvarı	I-5508 Serisi
1 adet PBS	Cellgro (corning)	21-040-Özgeçmiş
1/2 cc Lo-Dose u-100 insülin şırıngası 28 G1/2	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	329461
İyodonitrotetrazolyum klorür	Sigma	I10406 Serisi
Alet -leri
NAPCO serisi 8000 WJ CO2 inkübatörü	Termo bilimsel
Salıncak kovası rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf Belediyesi
C-1000 Termal döngüleyici	Biyo-RAD
ChemiDoc Görüntüleme Sistemi (jeller ve western lekeler için görüntüleme sistemi)	Biyo-RAD	17001401
Fare
ROSACreERT2	Jackson Laboratuvarı
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Evde yapılan
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Evde yapılan