Yöntem makalesi

Negatif İmmünomanyetik Seçim: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden B Hücrelerini Saflaştırmak İçin Bir Yöntem

30 Nisan 2023

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Serra S. ve ark. İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Hücre Dışı Nükleotid/Nükleosit Metabolizmasını İzlemek için HPLC Tabanlı Test. J. Vis. Uzm. (2016)

Video, immünomanyetik hedefleme ve periferik kan mononükleer hücre süspansiyonundan ayırma yoluyla B hücrelerini saflaştırmanın bir yolunu açıklıyor. Yöntem, istenmeyen hücre tiplerinin, manyetik ayırma yoluyla heterojen hücre süspansiyonundan tükenecek olan spesifik hücre yüzey proteinlerini hedefleyen spesifik antikorlar veya ligandlar (manyetik parçacıklara bağlı) ile etiketlenmesini içerir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lösemik B Hücrelerinin Negatif İzolasyon ile Saflaştırılması

  1. PBS% 0.1 sığır serum albümini (BSA) 2 mM EDTA, pH 7.4 (izolasyon tamponu) içinde 107 PBMC / ml'yi yeniden süspanse edin.
  2. 107 hücre için 10 μg fare monoklonal anti-CD3, -CD14 ve -CD16 birincil antikorları ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri izolasyon tamponu ile yıkayın ve 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  4. İzolasyon tamponundaki hücreleri 107 PBMC / ml'de yeniden askıya alın.
  5. Hücrelerle inkübe edilmeden önce, şişedeki koyun anti-fare IgG manyetik boncukları yeniden süspanse edin. 107 hücre başına 100 μl boncuk bir tüpe aktarın.
  6. 1 mL izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü 1 dakika boyunca bir mıknatıs tutucuya yerleştirin. Süpernatanı 5 ml'lik bir pipetle atın.
  7. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncukları 100 μl izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
  8. 10μl manyetik boncuk ile 10 7 hücreyi 30 dakika boyunca 4 ° C'de hafifçe eğme ve döndürme ile inkübe edin.
  9. Tüpü 2 dakika boyunca mıknatıs tutucuya yerleştirin ve CD19 + / CD5 + bağlanmamış hücrelerle süpernatanı 5 ml'lik bir pipet ile yeni bir tüpe aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan kanı
saflaştırılmış anti-CD3, -CD14, -CD16Evde üretilmiştirfare monoklonal
Dynabeads koyun anti-fare IgG Canlandırıcı 11031
Fosfat tamponlu salin (PBS) Amresco Belediyesi E404-200SEKMELERI Tablet
sığır serum albümini (BSA) Kimlik biyografisi 1000-70 Standart Sınıf
İzolasyon tamponu PBS %0,1 BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
DynaMag-15 Mıknatıs Canlandırıcı 12301D Dynal manyetik boncuk ayırıcı
arası

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Negative Immunomagnetic SelectionB cell PurificationPeripheral Blood Mononuclear CellsImmunomagnetic SeparationMagnetic Bead LabelingCD3 CD14 CD16 AntibodiesSecondary Antibody ConjugationMagnetic Field SeparationSupernatant CollectionChronic Lymphocytic Leukemia

İlgili makaleler