Negatif İmmünomanyetik Seçim: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden B Hücrelerini Saflaştırmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Serra S. ve ark. İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Hücre Dışı Nükleotid/Nükleosit Metabolizmasını İzlemek için HPLC Tabanlı Test. J. Vis. Uzm. (2016)

Video, immünomanyetik hedefleme ve periferik kan mononükleer hücre süspansiyonundan ayırma yoluyla B hücrelerini saflaştırmanın bir yolunu açıklıyor. Yöntem, istenmeyen hücre tiplerinin, manyetik ayırma yoluyla heterojen hücre süspansiyonundan tükenecek olan spesifik hücre yüzey proteinlerini hedefleyen spesifik antikorlar veya ligandlar (manyetik parçacıklara bağlı) ile etiketlenmesini içerir.

Protokol

1. Lösemik B Hücrelerinin Negatif İzolasyon ile Saflaştırılması

1. PBS% 0.1 sığır serum albümini (BSA) 2 mM EDTA, pH 7.4 (izolasyon tamponu) içinde 10⁷ PBMC / ml'yi yeniden süspanse edin.
2. 10⁷ hücre için 10 μg fare monoklonal anti-CD3, -CD14 ve -CD16 birincil antikorları ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Hücreleri izolasyon tamponu ile yıkayın ve 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
4. İzolasyon tamponundaki hücreleri 10⁷ PBMC / ml'de yeniden askıya alın.
5. Hücrelerle inkübe edilmeden önce, şişedeki koyun anti-fare IgG manyetik boncukları yeniden süspanse edin. 10⁷ hücre başına 100 μl boncuk bir tüpe aktarın.
6. 1 mL izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü 1 dakika boyunca bir mıknatıs tutucuya yerleştirin. Süpernatanı 5 ml'lik bir pipetle atın.
7. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncukları 100 μl izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
8. 10^μl manyetik boncuk ile 10 7 hücreyi 30 dakika boyunca 4 ° C'de hafifçe eğme ve döndürme ile inkübe edin.
9. Tüpü 2 dakika boyunca mıknatıs tutucuya yerleştirin ve CD19 ⁺ / CD5 ⁺ bağlanmamış hücrelerle süpernatanı 5 ml'lik bir pipet ile yeni bir tüpe aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsan kanı
saflaştırılmış anti-CD3, -CD14, -CD16	Evde üretilmiştir		fare monoklonal
Dynabeads koyun anti-fare IgG	Canlandırıcı	11031
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Amresco Belediyesi	E404-200SEKMELERI	Tablet
sığır serum albümini (BSA)	Kimlik biyografisi	1000-70	Standart Sınıf
İzolasyon tamponu			PBS %0,1 BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
DynaMag-15 Mıknatıs	Canlandırıcı	12301D	Dynal manyetik boncuk ayırıcı

arası