Hücre Dışı Pürin Metabolizması: Lösemik Hücrelerde Adenozin Üretimini ve Metabolizmasını Ölçmek İçin HPLC Tabanlı Bir Test

Özet

Kaynak: Serra S ve ark. İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Hücre Dışı Nükleotid/Nükleosit Metabolizmasını İzlemek İçin HPLC Tabanlı Test. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, lösemik kanser hücrelerinin hücre dışı ortamında AMP tüketimiyle üretilen adenozin ve ilişkili pürinlerin metabolizmasını ölçmek için kantitatif bir ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, farklı kültür koşulları altında saflaştırılmış kronik lenfositik lösemi (KLL) hücreleri tarafından üretilen hücre dışı pürin nükleotidlerinin ve nükleositlerinin miktar tayini için geliştirilmiş ve doğrulanmış hassas, spesifik, güvenilir ve tekrarlanabilir bir RP-HPLC testini tanımlar.

Protokol

1. Standart ve İnhibitörler Stok Çözeltilerinin Hazırlanması

1. AMP'yi hazırlamak için, 0.00345 g AMP'yi tartın ve 2 mM'lik standart bir AMP çözeltisine sahip olmak için 5 ml serumsuz ortamda çözün.
2. ADO'yu hazırlamak için, 0.00265 g ADO'yu tartın ve 2 mM'lik standart bir ADO çözeltisine sahip olmak için 5 ml serumsuz ortamda çözün.
3. INO'yu hazırlamak için, 0.00268 g INO'yu tartın ve 2 mM'lik standart bir INO çözeltisine sahip olmak için 5 ml serumsuz ortamda çözün.
4. 1 ml 2 mM stok solüsyonunu 4 ml serumsuz ortamda (5 ml nihai hacim) karıştırarak 400 μM'lik bir AMP, ADO ve INO çözeltisi hazırlayın.
   1. 400 μM çözeltinin 500 μl'sini 1.500 μl serumsuz ortamda (2 ml nihai hacim) pipetleyerek 100 μM konsantrasyon elde etmek için her 400 μM standart çözeltinin 1: 4 seyreltmesini yapın.
   2. Aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için serum içermeyen ortamda her bir bileşiğin seri seyreltmelerini hazırlayın: 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2.5 μM - 1 μM - 0.5 μM - 0.25 μM.
      Not: Örneğin, 50 μM konsantrasyon elde etmek için 1 ml 100 μM solüsyonu 1 ml serumsuz ortamda (1:2 seyreltme) pipetleyin ve kalan seyreltmelere devam edin.
5. PBS içinde çözülmüş 10 mM'lik bir APCP stok çözeltisi hazırlayın; alikot ve - 30 ° C'de stoklayın.
6. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş EHNA hidroklorür, dCF ve dipiridamol içeren 10 mM stok çözeltileri hazırlayın; alikot ve -30 ° C'de stoklayın.

2. HPLC Yöntemini Programlayın

1. 0.770 g amonyum asetatı 2 L çift deiyonize suda (Tampon A) çözerek 7 mM'lik bir amonyum asetat tamponu hazırlayın. Hidroklorik asit ile pH 3.0'a ayarlayın.
2. HPLC (Tampon B) için en az 2 L ultra saf asetonitril içeren bir cam şişe hazırlayın ve koruma kolonunu ve kolonu HPLC'ye bağlayın.
   Not: Sütunlar ve arabellekler kullanım sırasında RT konumundadır.
3. HPLC yazılımına giriş yapın ve "projeye göz at" düğmesini seçin. "Dosya" menüsüne gidin ve "yeni yöntem"i ve ardından "enstrüman yöntemi"ni seçin.
4. Dengeleme kolonu yöntemini Tablo 1'e göre programlayın. 1,00 ml/dk'lık bir akış hızı ayarlayın ve UV dedektörünü 260 nm'de okuyacak şekilde programlayın. Cihaz metodunu kaydedin ve "dosya" menüsünden tekrar "yeni metod"u ve ardından "metot seti"ni seçin. Daha önce kaydedilen cihaz yöntemini seçin ve aynı adla ayarlanan mevcut yöntem setini kaydedin.
5. Tablo 2.3'de belirtilen çalıştırma örneği yöntemini programlamak için 2 adımını tekrarlayın. 1,00 mL/dk'lık bir akış hızı ayarlayın ve UV dedektörünü 260 nm'de okuyacak şekilde programlayın. Cihaz yöntemini kaydedin ve yöntem setini kaydetmek için adım 4.4'te açıklanan prosedürün aynısını tekrarlayın.
6. "Örnekleri çalıştır" düğmesini seçin, "dosya" menüsünden "yeni örnek seti yöntemi"ni seçin.
7. "Boş" seçeneğini seçin ve şişenin numarasını (otomatik numune alma cihazında), numune adını, enjeksiyon hacmini (50 μl) girin. "Yöntem kümesi" sütunu için daha önce kaydedilen yöntem kümesini seçin ve toplam çalışma süresini (dk) girin.
   Not: Her numune çalışmasından önce "yöntem seti" sütununa dengeleme sütunu yöntemini (Tablo 1) girin ve toplam çalışma süresini (dk) girin.

3. Her bileşik için standart bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması

1. Tablo 1 ve Tablo 2'de açıklanan yöntemleri izleyerek 50 μl boş (adenozin deaminaz içermeyen spesifik serumsuz ortam) ve her standart numuneyi enjekte edin.
   1. Her numune çalışmasından önce dengeleme sütunu yöntemini (Tablo 1) kullanın ve yeterli tepe ayrımı elde etmek için Tablo 2'de açıklanan gradyan koşullarını ayarlayın. Bu HPLC koşulları altında AMP, ADO ve INO'nun bildirilen bekletme süreleri için Tablo 3'e bakın.
   2. HPLC yazılımındaki "işlem" düğmesini ve ardından "entegre et" seçeneğini seçerek farklı konsantrasyonlarda AMP, ADO ve INO'nun tepe alanını belirleyin. Alternatif olarak, her bir tepe noktasının başlangıç ve bitiş noktalarını manuel olarak seçin.
   3. Dokuz noktalı kalibrasyon eğrisini (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 μM) elde etmek için tepe alanlarını her bir standardın nominal konsantrasyonuna göre çizin.
   4. AMP, ADO ve INO için düz bir çizginin denklemini hesaplayın: y = mx + b,
      burada x, μM konsantrasyonudur ve y, tepe alanına karşılık gelir.

   Saat	Akış hızı (ml/dk)	%A	%B
   	Saat 1,00	100	0
   1,24	Saat 1,00	100	0
   6,22	Saat 1,00	2	98
   Saat 18,65	Saat 1,00	2	98

   Tablo 1: Dengeleme kolonu yöntemi. Kolonun dengelenmesi için çözücü değişikliklerinin şematik gösterimi. Tampon A: 7 mM amonyum asetat, pH 3.0. Tampon B: asetonitril.

   Saat	Akış hızı (ml/dk)	%A	%B
   	Saat 1,00	0	100
   3,74	Saat 1,00	0	100
   13,71	Saat 1,00	15	85
   Saat 17.00	Saat 1,00	100	0
   20.00	Saat 1,00	100	0

   Tablo 2: Örnek yöntemi çalıştırın. Pürin bileşiklerinin HPLC ölçümü için çözücü değişikliklerinin şematik gösterimi. Tampon A: 7 mM amonyum asetat, pH 3.0. Tampon B: asetonitril.

   	Saklama Süresi	λmaks
   Amp	8.00 dk	260
   ıno	11.00 dk	260
   gürültü	11.90 dk	260

   Tablo 3: Pürin bileşiklerinin alıkonma süreleri. AMP, ADO ve INO için gözlemlenen tipik alıkonma süreleri. UV dedektörü 260 nm'de okuyacak şekilde programlanmıştır.

   4. İnhibitörlerle Ön İşlem ve Substrat ile İnkübasyon (AMP)

   1. AMP tüketimini, CD73, ADA ve nükleosit taşıyıcılarının inhibisyonu olmadan ADO ve INO üretimini test etmek için, saflaştırılmış 2 x 10⁶ CD19 ⁺ / CD5 ⁺ CLL hücrelerini 250 μl serumsuz ortam ve plaka hücrelerinde 48 oyuklu bir plakada (veya 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünde) yeniden süspanse edin.
   2. 200 μM AMP'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 250 μl 400 μM AMP veya AMP plus inhibitörleri ekleyin. Boş numune olarak kullanılacak substratın yokluğunda bir koşul ekleyin.
   3. 37 ° C'de 30 ila 60 dakika arasında inkübe edin.
   4. İnkübasyon süresinin sonunda, 500 μl süpernatantları soğuk mikrosantrifüj tüplerinde (buz üzerinde) toplayın ve hemen 5 dakika boyunca 4 ° C'de 17.000 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanları yeni 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve hemen -80 °C'de saklayın veya HPLC çalışmaları için numune hazırlamaya devam edin.

   5. HPLC için Numune Hazırlama

   1. Süpernatanları 0,2 μm şırınga filtreleri ile yeni 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde filtreleyin. Filtreleme için 1 ml şırınga kullanın.
   2. HPLC sistemi bir otomatik numune alma cihazı ile sağlanmışsa, cam şişeleri HPLC için hazırlayın ve küçük hacimli numune için 0,1 ml'lik mikro ekleri kullanın.
   3. En az 100 μl numuneyi bir mikropipet veya bir cam Pasteur pipeti ile cam şişeye aktarın. Kabarcıklar olmadan aktarmaya ve şişeyi vidalı kapakla kapatmaya dikkat edin.
   4. Numuneler artık RP-HPLC ile analiz için hazırdır.

   6. Pürinlerin HPLC Ölçümleri

   1. "Örnekleri çalıştır" düğmesini seçin; "Dosya" menüsünden "yeni örnek seti yöntemi"ni seçin.
   2. "Boş" seçeneğini seçin ve şunu belirtin: flakonun numarası (otomatik numune alma cihazında), numune adı, enjeksiyon hacmi (50 μl).
   3. Takip eden tüm boş ve örnek çalıştırmalar için sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'de açıklanan dengeleme sütunu yöntemini ve çalıştırma örneği yöntemini seçin.
      not: Her numune çalışmasından önce dengeleme sütunu yöntemini (Tablo 1) ayarlayın.
   4. Her numuneden 50 μl boş (serumsuz ortam) enjekte edin.
   5. Her numunedeki pürin konsantrasyonunu belirleyin, Tablo 3'te açıklanan alıkonma sürelerinde tepe alanlarını elde ederek AMP, ADO ve INO'nun miktarını belirleyin.
      1. "İşlem" düğmesini ve ardından "entegre et" seçeneğini seçin. Alternatif olarak, alan ölçümünü elde etmek için her bir tepe noktasının başlangıç ve bitiş noktalarını manuel olarak seçin. Bu, zirvenin başlangıç ve bitiş noktaları arasında bir çizgi izlenerek yapılır.
      2. Standart eğri için elde edilen denklemi uygulayarak μM konsantrasyonunu belirleyin: y = mx + b, burada x μM konsantrasyonunu temsil eder ve y, bilinmeyen numuneden ölçülen tepe noktasıdır.
         NOT: ADO kalibrasyon standart eğrisinin bir örneği Şekil 1'de rapor edilmiştir, burada: x = (y alanı - 981.02)/40026
   6. 2 x 10⁶ hücrenin 0.500 ml ortamda yeniden süspanse edildiği göz önüne alındığında, aşağıdaki oranı uygulayarak 10⁶ CLL hücresi tarafından tüketilen ve/veya üretilen AMP, ADO ve INO μmollerini hesaplayın:
      μmol : 1.000 ml = x μmol : 0.250 ml
      not: 1.000 ml'deki μmoller (1 L'deki μmol sayısı) μM konsantrasyonuna eşdeğerdir ve x, 10⁶ hücre tarafından üretilen nükleotid veya nükleosit μmolleridir. Son olarak, μmolleri 10⁶ CLL hücresi tarafından tüketilen ve/veya üretilen nmollere dönüştürün: nmol = μmol x 1.000

Sonuçlar

Şekil 1.Dahili bir standart eğrinin oluşturulması.ADO için temsili kalibrasyon standart eğrisi ve elde edilen bağıl denklem. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AIM V serum içermeyen ortam	GIBCO Bilişim Teknolojileri	12055-091	Sıvı (araştırma notu)
adenozin 5'-monofat (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenozin (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosin (INO)	Sigma-Aldrich	I4125 Serisi
asetonitril (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC sınıfı
Amonyum Asetat	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
kısa iplikli şişeler	VWR (VWR)	548-0029	1,5 ml/bardak
Mikro ekler	VWR (VWR)	548-0006	0.1 ml / bardak
vidalı kapaklar	VWR (VWR)	548-0085	9 mm/PP mavi
Atlantis dC18 Sütunu	Sular	186001344	5 μm, 4,6 mm x 150 mm
Atlantis dC18 Muhafız Kolonu	Sular	186001323	5 μm, 4,6 mm x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separasyon Modülü	Sular		HPLC ayırma modülü
Waters 2998 Fotodiyot Dizisi (PDA) Dedektörü	Sular		UV dedektörü
Waters Empower2 yazılımı	Sular

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi adet Gazetesi adet