Hücre Dışı Pürin Metabolizması: Lösemik Hücrelerde Adenozin Üretimini ve Metabolizmasını Ölçmek İçin HPLC Tabanlı Bir Test

Özet

Kaynak: Serra S ve ark. İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Hücre Dışı Nükleotid/Nükleosit Metabolizmasını İzlemek İçin HPLC Tabanlı Test. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, lösemik kanser hücrelerinin hücre dışı ortamında AMP tüketimiyle üretilen adenozin ve ilişkili pürinlerin metabolizmasını ölçmek için kantitatif bir ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, farklı kültür koşulları altında saflaştırılmış kronik lenfositik lösemi (KLL) hücreleri tarafından üretilen hücre dışı pürin nükleotidlerinin ve nükleositlerinin miktar tayini için geliştirilmiş ve doğrulanmış hassas, spesifik, güvenilir ve tekrarlanabilir bir RP-HPLC testini tanımlar.

Protokol

1. Standart ve İnhibitörler Stok Çözeltilerinin Hazırlanması

1. AMP'yi hazırlamak için, 0.00345 g AMP'yi tartın ve 2 mM'lik standart bir AMP çözeltisine sahip olmak için 5 ml serumsuz ortamda çözün.
2. ADO'yu hazırlamak için, 0.00265 g ADO'yu tartın ve 2 mM'lik standart bir ADO çözeltisine sahip olmak için 5 ml serumsuz ortamda çözün.
3. INO'yu hazırlamak için, 0.00268 g INO'yu tartın ve 2 mM'lik standart bir INO çözeltisine sahip olmak için 5 ml serumsuz ortamda çözün.
4. 1 ml 2 mM stok solüsyonunu 4 ml serumsuz ortamda (5 ml nihai hacim) karıştırarak 400 μM'lik bir AMP, ADO ve INO çözeltisi hazırlayın.
   1. 400 μM çözeltinin 500 ....

Sonuçlar

Şekil 1.Dahili bir standart eğrinin oluşturulması.ADO için temsili kalibrasyon standart eğrisi ve elde edilen bağıl denklem. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AIM V serum içermeyen ortam	GIBCO Bilişim Teknolojileri	12055-091	Sıvı (araştırma notu)
adenozin 5'-monofat (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenozin (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosin (INO)	Sigma-Aldrich	I4125 Serisi
asetonitril (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC sınıfı
Amonyum Asetat	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
kısa iplikli şişeler	VWR (VWR)	548-0029	1,5 ml/bardak
Mikro ekler	VWR (VWR)	548-0006	0.1 ml / bardak
vidalı kapaklar	VWR (VWR)	548-0085	9 mm/PP mavi
Atlantis dC18 Sütunu	Sular	186001344	5 μm, 4,6 mm x 150 mm
Atlantis dC18 Muhafız Kolonu	Sular	186001323	5 μm, 4,6 mm x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separasyon Modülü	Sular		HPLC ayırma modülü
Waters 2998 Fotodiyot Dizisi (PDA) Dedektörü	Sular		UV dedektörü
Waters Empower2 yazılımı	Sular

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi adet Gazetesi adet