Floresan Etiketli T-ALL Hücreleri İzolasyonu: Yetişkin Zebra Balıklarından T-ALL Hücrelerini İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Pruitt, M. M., et al. Zebra Balığında Myc ile İndüklenen T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemide Yan Popülasyonun İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu protokol, floresan olarak işaretlenmiş T hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) tümör hücrelerini yetişkin bir zebra balığından izole etme ve bunları tripan mavisi boya kullanarak ölçme tekniğini açıklar.

Protokol

1. Primer tümör balıklarından floresan etiketli T-ALL hücrelerinin toplanması

1. 0.9x fosfat tamponlu salin (FBS / PBS) içinde en az% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu hazırlayın.
2. Bir şişe heparin sodyum tuzuna (300 birim) 1 mL FBS / PBS ekleyin.
3. Vücudun% 50'sinden fazlasında tümör taşıyan balıkları veya yemek yemekte veya yüzmede zorluk çeken balıkları seçin. Balıkları aşırı dozda tricaine veya buzlu suya daldırarak feda edin. Solungaç hareketi ve kalp atışı eksikliği ile ölümü onaylayın.
4. Balığın kafasını çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.
5. Fazla kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için balığın boşluğunu heparin solüsyonu ile yıkayın.
   1. Bir pipet kullanarak, balığın vücut boşluğuna 100 μL heparin çözeltisi enjekte edin (bir şişe heparin sodyum tuzuna 1 mL FBS / PBS ekleyin). Dökülen tüm sıvıyı çıkarın (kan hücreleri içerecektir) ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
   2. Vücudu tekrar yıkamak için yeni bir pipet ucu kullanın. En az üç yıkama yapın veya dökülen sıvı kansız görünene kadar yapın.
   3. Daha sonraki analizlerde kullanılmayacağı için bu adımlarda yıkamalardaki tüm sıvıyı atın.
6. Lösemi hücrelerini toplayın.
   1. Balığın vücut boşluğuna 100 μL FBS/PBS enjekte edin.
   2. Tümör hücrelerini sıkmak/dışarı itmek için pipet ucuyla balığın vücudunun dışına hafif bir baskı uygulayın.
      not: Bu adım bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilirse, vücut boşluğundan dökülen tümör hücreleri belirgin olacaktır.
   3. Her yıkamadan gelen sıvıyı ve hücreleri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
   4. Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar (genellikle 5-10 kez) 1.6.1-1.6.3 adımlarını tekrarlayın. Tüm tümör hücrelerini aynı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında tutun.
7. Toplanan tümör hücrelerini, hücre kümelerini ayırmak için nazikçe pipetleyerek önceki adımdan karıştırın. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir ağ filtreden süzün. Filtreyi 100 μL FBS/PBS ile 1-2 kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında tutun.
8. Yeni bir tüpte 2 μL hücre süspansiyonunu 18 μL tripan mavisi (% 0.4, 1:10 seyreltilmiş ve süzülmüş) ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL yükleyin ve izole edilmiş tümör hücrelerinin sayısını hesaplamak için canlı (mavi olmayan) floresan hücrelerin sayısını sayın.
   not: Mavi olmayan GFP negatif hücreler muhtemelen normal, malign olmayan T hücreleridir ve sayılmamalıdır. Hücreleri Hoechst 33342 ile boyamak için en az 2 x^{10 6} hücre gereklidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sinjeneik zebra balığı (CG2)			Bkz. Mizgireuv ve ark., 2006
Rag2: C-Myc Plazmidi			Langenau Laboratuvarı
rag2: De Jong Laboratuvarı'nda inşa edilen GFP plazmidi			Langenau Laboratuvarı'ndan rag2 organizatörü
pCS2-transpozaz plazmidi			Chien Laboratuvarı
SteREO Discovery V8 Mikroskobu	Carl Zeiss Mikroskobu	495015-0008-000
Trikain metansülfonat (MS-222)	Batı Kimya A.Ş	Fisher Scientific - NC0342409	100 gr
Fetal sığır serumu (FBS)	HyClone Laboratuvarları, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Gibco by Life Technologies	1001-023	pH 7.4 (1x) - 500 mL
Heparin sodyum tuzu	Sigma-Aldrich	2106	15 - 300 birim flakon
40 μm gözenekli filtre	Falcon Corning Markası	352340	50 kişilik vaka
Tripan mavisi	Sigma Yaşam Bilimleri	T8154	20 mL - Çözelti (% 0.4)