$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Yan Popülasyonu Tanımlamak için Floresan Etiketli T-ALL Hücrelerinin Hoechst 33342 ile Boyanması
- 1 mg / mL çalışma konsantrasyonunu elde etmek için Hoechst 33342 10 1:10'u nükleaz içermeyen H2O ile seyreltin. Boyayı 4 °C'de ve karanlıkta saklayın.
- 49.1 mg'ı 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek 100 mM'lik bir verapamil çözeltisi hazırlayın.
not: Verapamil, ABC taşıyıcılarının bir inhibitörüdür ve yan popülasyon deneyleri için önemli bir kontroldür. Numunelere verapamil eklemek, ABC taşıyıcılarının Hoechst 33342 boyasını dışarı akıtma kabiliyetini engelleyecektir. Bu nedenle, örneğe verapamil eklendiğinde gerçek bir yan popülasyon ortadan kalkacaktır.
- Su banyosunu 28 °C'ye ayarlayın.
- Floresanla etkinleştirilen hücre sıralayıcı (FACS) tüplerine hücreler ve çözeltiler ekleyerek karanlıkta numuneler ve kontroller hazırlayın.
- Bir FACS tüpüne 106 hücre, 15 μL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 μL DMSO ekleyerek numuneleri hazırlayın. FBS/PBS ile ses seviyesini 1 mL'ye ayarlayın.
- Bir FACS tüpüne 106 hücre, 15 μL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 μL 100 mM verapamil ekleyerek kontrolleri hazırlayın. FBS/PBS.
ile ses seviyesini 1 mL'ye ayarlayın
not: En az 106 hücre / numune önerilir, ancak özellikle yan popülasyon hücreleri daha fazla analiz için sıralanacaksa, daha fazla hücrenin boyanması tercih edilir. 106 hücre / mL'yi aşmayın ve Hoechst 33342 konsantrasyonunu 15 μg / mL'de tutun. 10 x 106 hücre boyanırsa, toplam reaksiyon hacmi 10 mL'dir.
- Karanlıkta 28 °C su banyosunda 120 dakika inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, hücreleri hemen buzun üzerine yerleştirin ve karanlıkta tutun.
- Hücreleri 4 ° C'de 6 dakika boyunca 300 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS/PBS ile yıkayın.
- Hücreleri 4 ° C'de 6 dakika boyunca 300 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı çıkarın. Hücreleri 1 mL FBS / PBS'de yeniden süspanse edin.
- Hücre sıralanana kadar 4 °C'de tutun.
- Hücre sıralamasından 15 dakika önce, her 1 mL FBS/PBS'ye (nihai konsantrasyon: 2 μg/mL) 2 μL propidyum iyodür (PI) stoğu (1 mg/mL) ekleyin. İyice karıştırın.
2. Floresan Etiketli T-ALL Hücre Popülasyonu İçindeki Yan Popülasyonu Bulmak için FACS'yi Kullanın
- Hoechst 33342 boya uyarımı için UV lazer ve PI uyarımı ve GFP + T-ALL hücrelerinin tespiti için 488 nm lazer ile donatılmış bir hücre sıralayıcıda lekeli zebra balığı T-ALL hücre süspansiyonlarını analiz edin.