İn Vitro Pankreatik Nöroplastisite Deneyi: Sağlıklı ve Kanserli İnsan Pankreas Dokusu Ekstraktlarına Maruz Kalan GI Yolu Nöronlarındaki Değişikliklerin İncelenmesi

Özet

Kaynak: Demir, İ. E., et al. Pankreatik Nöroplastisite Simülasyonu: İn Vitro Çift Nöron Plastisite Testi. J. Vis. Uzm. (2014).

Bu video, sağlıklı ve kanserli insan pankreas dokusu ekstraktlarına maruz kalan dorsal kök gangliyonları ve myenterik pleksus nöronlarındaki morfolojik değişiklikleri incelemek için in vitro nöroplastisite testini göstermektedir. Bu tahlil, nörit büyümesini, dallanma modelini ve nöronal boyutu incelememize izin verir.

Protokol

1. Nöronların İzolasyonu

Ekstrakt/süpernatant toplama işlemi bittiğinde, nöronların izolasyonu ile devam edin.

1. DRG nöronları için, DRG'nin dekapitasyonu ve stereomikroskobik diseksiyonundan sonra doğum sonrası (P) 2-12 arasında yenidoğan sıçanların servikal ila lomber DRG'sini toplayın (Şekil 1A). 24 oyuklu bir plaka için yeterli DRG nöronlarına sahip olmak için, plaka başına bir yenidoğan sıçanın (52 DRG'ye eşit) tüm servikal ve lomber DRG'sini toplayın.
2. DRG'nin periferik (nöral) ve merkezi çıkıntılarını (köklerini) mikromakas yardımıyla kesin. Projeksiyonları yerinde bırakmak tritürasyonu engeller ve kültürün fibroblastlar tarafından kontaminasyon riskini artırır.
3. MP nöronları için, mezenteri ince bağırsaktan kesin ve ince bağırsağın seromüsküler tabakasını manuel ve dikkatli bir şekilde çıkarın (MP izolasyonu ile ilgili ayrıntılı bir protokol için, Şekil 1B). MP için, pleksusu 24 oyuklu plaka başına iki sıçandan toplayın.
   not: Seromüsküler tabakadaki yırtılmaları önlemek için mümkün olduğunca nazik olmaya çalışın, çünkü bunlar ince bağırsaktan başarılı bir şekilde ayrılmasını engeller.
4. DRG ve seromüsküler tabakayı, gentamisin (500 ml ortamda 20 mg) ve metronidazol (500 ml ortamda 2.5 mg) ile sağlanan buz gibi soğuk minimal esansiyel ortamda (MEM) toplayın.
5. DRG'nin toplanmasını takiben, kollajenaz Tip II ile sağlanan Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 20-30 dakika inkübe edin. MP izolasyonu için, hayvanın yaşına bağlı olarak 1-3 saat arasında kollajenaz tipinde inkübe edin (Şekil 1C).
6. MP için, ağ benzeri MP parçalarını bir stereomikroskop altında toplayın ve buz gibi soğuk MEM'e aktarın.
7. Daha sonra DRG ve MP'yi çapı azalan şırıngalarla tritüre edin.
   not: Aşırı yıpranma nöronları tahrip edebilir, ancak glial hücreleri daha az tahrip edebilir.
8. DRG veya MP içeren ortam bulanıklaştığında, süspansiyonu 5 dakika boyunca 93.9 x g'da santrifüjleyin, ortamı atın ve Nörobazal ortamda yeniden süspanse edin (100 U / ml penisilin, 100 μg / ml streptomisin, 0.5mM L-glutamin ve% 2 B-27).
9. Bir hemositometre vasıtasıyla toplam hücre sayısını (yani nöronlar VE glia) sayın.
   not: İhtiyaç duyulan hücre sayısı ölçüm parametresine bağlıdır. Nörit yoğunluğunun ölçülmesi için, nörit büyümesinin, perikaryonal boyutunun ve tek tek nöronların dallanma modelinin ölçümünden daha yoğun kültürlere ve dolayısıyla daha fazla sayıda hücreye ihtiyaç vardır. Nörit yoğunluğu ölçümleri için örneğin 10.000 hücre (nöron + glia) / kuyu veya 1.500 nöron / kuyu kullanın. Bireysel nöronlar üzerinde morfometri için, hücrelerin kısa (1 dakika uzunluğunda) triplizasyonu ve 2.500 hücre / kuyu veya 400 nöron / kuyu tohumlanması önerilir. Bir sıçandan elde edilen tipik hücre verimi 300.000-500.000 hücre civarındadır.
10. Hücreleri bir gece önceden kaplanmış 13 mm'lik lamellere tohumlayın ve kuyucukları Nörobazal besiyeri (100 U/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ve %2 B-27 ile desteklenmiş) ile doldurun (Şekil 1D).
    not: Poli-D-lizin (40 mg /^m2) VEYA ornitin ve laminin kaplı (her biri 1 mg / ml) kaplı lameller kullanın. Hücreler poli-D-lizine son derece hızlı bağlanır, böylece birçok hücrenin gerekli olduğu deneyler için uygun hale getirir (yani nörit yoğunluğu ölçümleri). Laminine bağlanma genel olarak biraz daha zayıftır, ancak laminin, nörit büyümesinin güçlü bir destekleyicisidir. Bu nedenle, nöronal dallanma ve nörit uzunluğu ile ilgili ölçümler için ornitin / laminin kaplamayı tercih edin.
11. Hücrelerin gece boyunca kuyucuklara yapışmasına izin verin. Ertesi gün, ekstrakt takviyeli ortamı hazırlayın (100 μg/ml'lik son ekstrakt/süpernatan konsantrasyonunda).
12. Tohumlama ortamını aspire edin ve PBS ile isteğe bağlı, çok nazik bir yıkama yapın ve ardından ekstrakt/süpernatan takviyeli ortamı yavaşça pipetleyin (Şekil 1E).
13. Hücrelerin 48 saat büyümesine izin verin. Ortamı aspire edin ve immün boyama için% 4 paraformaldehit ile sabitleyin (Şekil 1F).
14. Nörona özgü (ör. beta III-tubulin) ve gliaya özgü (ör. glial, fibriler asidik protein / GFAP) belirteçleri kullanarak çift immünofloresan boyama yapın (Şekil 1G).
15. Morfometri için, nörit yoğunluğunun ölçülmesine izin veren otomatik yazılımla birlikte bir CCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın (Tabloya bakınız).
16. Nöronal kültürlerin nörit yoğunluğu, 50 μm x 50 μm'lik bir ızgaranın üst üste bindirilmesi ve kesişen liflerde ölçülen kare başına lif yoğunluğunun sayılmasıyla her bir lamel üzerindeki en yoğun büyümenin 4 farklı bölgesinden 200x büyütmede 4-5 temsili fotomikrograf üzerinde ölçülür. Nörit büyümesi, nöron başına ortalama dal sayısı, ortalama dal uzunluğu ve perikaryonal boyut, nöritler ve perikarya işaretlenerek her bir lamden rastgele seçilen 30 soliter nörondan ölçülebilir (Şekil 1H).

Sonuçlar

Şekil 1. İn vitro nöroplastisite testinin şematik protokolü. Bu test, pankreas dokusu ekstraktlarının veya hücre süpernatanlarının nöronal ve glial morfoloji üzerindeki etkisini incelemek için yenidoğan sıçan dorsal kök gangliyonları (DRG) ve myenterik pleksus (MP) nöronlarını kullanır. Anterior laminektomi sonrası DRG toplanır ve ince bağırsağın (A, B) rezeksiyonu ve mekani...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Poli-D-lizin hidrobromür	Sigma-Aldrich	P1149 Serisi
Ornitin/laminin	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Lameller	Merck		24 oyuklu plakada kullanım için
Çözücü S	Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antikoru	Kırlangıç	MAB1637	1:200 konsantrasyon
Anti-GFAP-antikoru	DAKO	M0761	1:400 konsantrasyon
RIPA tamponu + proteaz inhibitörü			Herhangi bir tedarikçi
Nörobazal ortam	Gibco/Yaşam Bilimleri	21103-049
B-27 Takviyesi	Gibco/Yaşam Bilimleri	17504044	B-27'nin kalitesinin lot numarasına bağlı olduğu bilinmektedir
Gentamisin/Metronidazo			Herhangi bir tedarikçi
Minimal esansiyel ortam	Gibco/Yaşam Bilimleri	31095-029
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Gibco/Yaşam Bilimleri	24020133	Ca/Mg içerdiğinde kollajenaz aktivitesini iyileştirir
Kollajenaz tip II	Worthington Biyokimyasal	CLS-2	En az 200 U / mg aktiviteye sahip lotlar elde edin
Tripsin-EDTA %0.25	Gibco/Yaşam Bilimleri	25200056
% 4 Paraformaldehit			Herhangi bir tedarikçi
AnalySIS doküman yazılımı	Olympus

Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Serisi