CRC Hücrelerinde Fosfataz Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Fosforilasyon Durumunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Huda, M. N., et al. Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Lokalizasyonu ile Birlikte Fosforilasyon ve Mikrotübül Bağlanma Testi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, kolorektal kanser hücrelerinde bir fosfataz testi ile tau proteininin fosforilasyon durumunu değerlendirmek için bir protokolü açıklar. Fosfataz enzimi, tau proteini üzerinde bulunan fosfat grupları üzerinde etki ederek, tedavi edilmemiş tau proteini örneklerine kıyasla tau proteininin SDS PAGE jeli üzerindeki hareketliliğini arttırır.

Protokol

1. Fosfataz Testi

1. Hücreler ~% 65 birleşmeye ulaştığında (mikroskopi kullanılarak yaklaşık) hücre lizatlarını tedavi edin, MEM takviyeli ortamı çıkarın ve 5 μM, 10 μM ve 30 μM kurkumin veya 25 mM, 50 mM ve 100 mM LiCl ile serumsuz MEM ekleyin. İşlemden 24 saat sonra% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin, hücreleri 1 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın ve hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın. Kazınmış hücreleri 1.5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve hücre peletleri elde etmek için 4 ° C'de 1.800 x g'de 4 dakika santrifüjleyin. Tüplere düzenli olarak dokunurken peletleri 100 μL tam RIPA tamponunda 4 ° C'de 20 dakika boyunca süspanse ederek hücreleri parçalayın. Örnekleri kısaca sonikleştirin. Hücre homojenatlarını 22.570 x g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyin. Süpernatantları, alkalin fosfataz tamponunda alkalin fosfataz ile bir pipet kullanarak diğer etiketli tüplere aktarın.
   1. Hem kontrol hem de tedavi edilmiş numuneler için, 20 μg toplam protein içeren 20 μL'lik numuneler hazırlayın. Toplam 20 μg protein içeren hücre lizatlarının hacmini, ardından 2 μL alkalin fosfataz tamponu ve 10 μL alkalin fosfataz ekleyin. 20 μL oluşturmak için damıtılmış su ekleyin.
2. Numuneleri 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. 50 mM'lik bir son konsantrasyonda etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek veya 10 mM'lik bir son konsantrasyonda sodyum ortovanadat (_Na3VO4) ekleyerek reaksiyonu durdurun. Reaksiyon, 75 °C'de 5 dakika ısıtılarak da durdurulabilir.
3. Fosfataz ile numunelerin inkübasyonu bitmeden önce, fosfataz ile muamele edilmiş numunelerle karşılaştırmak için fosfataz eklemeden aynı konsantrasyonda numuneler hazırlayın.
4. 400 mM DTT içeren taze hazırlanmış 4X SDS jel yükleme tamponunu ekleyin.
5. Numuneleri 100 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika inkübe edin. Numuneleri bir girdap kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında ~ 10-15 dakika soğutun.
6. SDS-PAGE ile %10'luk bir poliakrilamid jeli çalıştırmak için bir elektroforez sistemi kurun.
   1. % 10'luk bir poliakrilamid jel üzerine oyuk başına 10 μg protein (13 μL numune) yükleyin. Moleküler ağırlıklı merdiveni yükleyin.
   2. Numuneyi yükledikten sonra, sabit bir voltaj sağlamak için elektroforez sisteminin pozitif ve negatif elektrotlarını bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, protein örneklerini istifleme jelinden çözme jeline taşımak için 20 dakika boyunca 70 V'ta başlayın. Ardından, voltajı 125 V'a yükseltin ve numuneler ve protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70-120 dakika çalıştırın.
   3. Elektroforezin tamamlanmasından sonra, jeli ıslak bir elektroblotlama sistemi kullanarak bir PVDF membranına aktarın. 100 V'ta ~ 100 dakika aktarın.
   4. Moleküler ağırlıklı merdivenin yan tarafında küçük bir kesik yaparak lekeyi işaretleyin. Lekeyi kesmek için şeffaf bir plastik tabaka ve keskin bir kesici kullanın.
7. Membranı oda sıcaklığında 90 dakika boyunca %4'lük bir BSA bloke edici tamponda bloke edin.
8. Lekeyi gece boyunca 4 ° C'de primer-antikor çözeltisinde (1: 5.000'de anti-tau) inkübe edin. Lekeyi PBST'de her biri 7 dakika boyunca dört kez yıkayın.
9. İlgili ikincil antikor çözeltisini hazırlayın (1: 5.000'de keçi anti-fare IgG) ve lekeyi oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. PBST'de her biri 7 dakika boyunca dört kez yıkayın.
10. Üreticinin tavsiyelerine göre bir kemilüminesans kiti kullanarak lekeyi geliştirin. Lekeyi şeffaf plastik sargı ile örtün. İlgili yazılımla kemilüminesans için bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile görüntüler elde edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HCT 116 hücresi	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-247
100 mm çanak	Corning	430161
MEM (EBSS)	Klon	SH30024.01
Fetal Sığır Serumu (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	-20 °C'de saklayın
Anti-Tau 13 antikoru	Abcam Belediyesi	AB19030
Ditiyotreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Depolama Sıcaklığı 2–8 °C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Depolama Sıcaklığı 2–8 °C
Anti-Tau (fosfo S396) antikoru	abcam (abcam)	AB109390
FastAP Isıya Duyarlı Alkalin Fosfataz	Termo Bilimsel	EF0651	-20 °C'de saklayın
PMSF (Başbakanlık)	Sigma	P7626	Oda sıcaklığında saklayın
Fosfataz İnhibitör Kokteyli	Hücre Sinyalizasyonu	5870 Adet	4 °C'de saklayın
Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Hücre Sinyalizasyonu	5871	4 °C'de saklayın
Keçi anti-fare IgG İkincil Antikoru	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-11005	Karanlıkta 4 °C'de saklayın
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Affymetrix (Affymetrix)	75819
Moleküler Görüntüleyici	Biyo-Rad	ChemiDoc XRS+	4 °C'de saklayın
RIPA Tamponu	Sigma	R 0278	Depolama Sıcaklığı 2–8 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Yaklaşık 25 °C'de saklayın
PVDF membran	Biyo-Rad	162-0177
Keçi anti-fare IgG İkincil Antikoru	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-11005	Karanlıkta 4 °C'de saklayın
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Affymetrix (Affymetrix)	75819
Protein tahlili boya reaktifi	Biyo-Rad	500-0006
Sonik Çözücü	Balıkçı Bilimsel	Ürün Modelleri 500
Mikrolitre Santrifüjler	Hettich Zentrifugen	MİKRO 200 R