CRC Hücrelerinde Fosfataz Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Fosforilasyon Durumunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Huda, M. N., et al. Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Lokalizasyonu ile Birlikte Fosforilasyon ve Mikrotübül Bağlanma Testi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, kolorektal kanser hücrelerinde bir fosfataz testi ile tau proteininin fosforilasyon durumunu değerlendirmek için bir protokolü açıklar. Fosfataz enzimi, tau proteini üzerinde bulunan fosfat grupları üzerinde etki ederek, tedavi edilmemiş tau proteini örneklerine kıyasla tau proteininin SDS PAGE jeli üzerindeki hareketliliğini arttırır.

Protokol

1. Fosfataz Testi

1. Hücreler ~% 65 birleşmeye ulaştığında (mikroskopi kullanılarak yaklaşık) hücre lizatlarını tedavi edin, MEM takviyeli ortamı çıkarın ve 5 μM, 10 μM ve 30 μM kurkumin veya 25 mM, 50 mM ve 100 mM LiCl ile serumsuz MEM ekleyin. İşlemden 24 saat sonra% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin, hücreleri 1 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın ve hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın. Kazınmış hücreleri 1.5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve hücre peletleri elde etmek için 4 ° C'de 1.800 x g'de 4 dakika santrifüjleyin. Tüplere düzenli olara....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HCT 116 hücresi	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-247
100 mm çanak	Corning	430161
MEM (EBSS)	Klon	SH30024.01
Fetal Sığır Serumu (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	-20 °C'de saklayın
Anti-Tau 13 antikoru	Abcam Belediyesi	AB19030
Ditiyotreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Depolama Sıcaklığı 2–8 °C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Depolama Sıcaklığı 2–8 °C
Anti-Tau (fosfo S396) antikoru	abcam (abcam)	AB109390
FastAP Isıya Duyarlı Alkalin Fosfataz	Termo Bilimsel	EF0651	-20 °C'de saklayın
PMSF (Başbakanlık)	Sigma	P7626	Oda sıcaklığında saklayın
Fosfataz İnhibitör Kokteyli	Hücre Sinyalizasyonu	5870 Adet	4 °C'de saklayın
Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Hücre Sinyalizasyonu	5871	4 °C'de saklayın
Keçi anti-fare IgG İkincil Antikoru	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-11005	Karanlıkta 4 °C'de saklayın
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Affymetrix (Affymetrix)	75819
Moleküler Görüntüleyici	Biyo-Rad	ChemiDoc XRS+	4 °C'de saklayın
RIPA Tamponu	Sigma	R 0278	Depolama Sıcaklığı 2–8 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Yaklaşık 25 °C'de saklayın
PVDF membran	Biyo-Rad	162-0177
Keçi anti-fare IgG İkincil Antikoru	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-11005	Karanlıkta 4 °C'de saklayın
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Affymetrix (Affymetrix)	75819
Protein tahlili boya reaktifi	Biyo-Rad	500-0006
Sonik Çözücü	Balıkçı Bilimsel	Ürün Modelleri 500
Mikrolitre Santrifüjler	Hettich Zentrifugen	MİKRO 200 R

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Haber Bülteni Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi