Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

1. Embriyoların geliştirilmesi

1. Serilir zaman, yumurta koryon eklenti filamentler, çünkü kümelenmiş. Embriyoların normal geliştirmek izin vermek için, ayrı yumurta gereklidir. Karışmayan ve iki forseps ile ek filamentler tutarak eklenti filamentler kesmek.
2. Unclustering sonra dışkı ve yosun, yumurta ayrılır ve maksimum yoğunluk 6cm Petri kabı başına 40 yumurta, taze embriyo orta transfer.
3. Medaka embriyoların 27 zebrafish biraz daha yavaş gelişir ° C. Iki tür arasında kuluçka zamanlaması farklıdır; Medaka embriyolar, 7 gün içinde koryon yumurtadan çıkar ve hemen zebrafish embriyoların 2 gün içinde yumurtadan ise yüzmek ve yemeye başlar ancak 5-6 gün denize girmek ve yemeye başlar. Medaka Geliştirme Iwamatsu hazırlama ⁴ göre sahnelenir.
4. Medaka embriyo gelişimi deneysel planlarına uygun sıcaklık seçerek rahatlıkla ayarlanabilir. Medaka embriyoların Kalkınma erken gelişim 4 ° C'de durdurulabilir. Aşamada 24 saat sonra kalp atmaya başladığında, geliştirme minimum sıcaklık 18 ° C ile yavaşlatılabilir.
5. Zebrafish somitegenesis beyin gelişimi öncesinde ise organ / dokuların görünümü zamanlama zebrafish ile karşılaştırıldığında Medaka biraz daha farklı, Medaka somitogenesis yani beyin gelişimi başlamasından sonra ortaya çıkar.

2. Koryon çıkarma

Medaka koryon sert bir iç tabaka ve yumuşak bir dış yüzeyi ile iki koruyucu tabaka oluşur. Böylece, bir iki adım proteaz tedavi pronase ve kuluçka enzim istihdam koryon kaldırmak için gereklidir.

Bir kez dechorionated, embriyoların 1X BSS tutulmalıdır. Yarı steril koşullarda uzun süreli gözlem gereklidir, özellikle dechorionated embriyoların başarılı kültür artıracaktır. Bunlar% 70 etanol ile 1X BSS ile durulama ardından steril steril solüsyonların kullanımı (örneğin antibiyotik ile 1X BSS sterilize) ve araçları kullanarak içerir.

Dechorionated Medaka embriyolar dechorionated zebrafish embriyolar daha yumuşak ve daha kırılgan olduğu için, ekstra bakım sağlamak için pipet hava kabarcıkları temasa geçmeyiniz, bu ani çöküşü neden olarak alınmalıdır. Embriyoların en az zararla sağlamak için, geniş ağızlı ısı pipet pompa ile parlatılmış cam pipet embriyolar transfer için kullanılan olmalıdır ve bir saç döngüsü, gözlem için embriyolar yolunuzu kullanılmalıdır. Sigara yapışık Petri kutularına embriyolar yüzeylere tutunmasını önlemek için kullanılmalıdır.

1. Dechorionation için önce yumurta yeterince ayrılmış ve temizlenmiş olduğu kontrol edilmelidir.
2. Pronase ve kuluçka enzimler proteinazı olduğundan, buz üzerinde tutulmalıdır ve bu enzimlerin embriyoların maruziyeti en aza indirmek olmalıdır.
3. Zımpara (P2000 tane iriliğine, su geçirmez) 9cm petri kabı kapağı yerleştirilir yumurta transferi. Aşırı orta çıkarın ancak embriyo kurumasını önlemek için yeterli bir hacim kalmasını sağlamak.
4. Dış yüzeyi kılların bazılarını kaldırın ve hafifçe koryon yüzeyinde (Şekil 1) puan 45-60 saniye için embriyolar yavaşça döndürün. Orijinal Petri kabı geri embriyo transferine ve incelemek.
   
   Zımpara üzerinde yuvarlanma embriyolar minimum basınç uygulayarak ve zımpara kağıdı yüzeyinde parmak paralel tutulması, işaret parmağı kullandığınızda. Bir defada 5-7 embriyolar daha fazla rulo etmeyin. Bu önlem, embriyoları birbirlerine altında ezilme riski en aza indirecektir.
   
   
5. 27 20mg/ml pronase ve 40-60 dakika inkübe embriyolar ile bulaşık yumurta orta değiştirin ° C.
   
   Emin olun embriyolar yeterince pronase kapsadığı ve yemeğin üzerine bir kapak bulunur. Kullanılmayan pronase öz-sindirimi en aza indirmek için bu adımı sırasında buz üzerinde tutulmalıdır ve aktivite (yaklaşık 1-2 hafta) kaybolana kadar tekrar edilebilir.
   
   
6. Pronase, yeniden kullanım ve 5X yıkama embriyolar eklenecek kuluçka enzim inaktive olarak pronase izlerini kaldırmak için embriyonun orta kurtarma.
7. Embriyolar tek tabakalı bir çanak olarak oturup sağlamak, kuluçka enzim ile embriyo orta ve kapak embriyolar çıkarın.
   
   Yumurta çanak biri diğerinin üstüne oturup koryon erirken, altta kalanlar ezilmiş olacak. Buz üzerinde kullanılmayan kuluçka enzim tutun.
   
   
8. 27 embriyolar ° C'de ve 15 dakika sonra bir stereomikroskopta kullanarak kuluçka ilerleme periyodik olarak kontrol edin.
   
   Bu ay krater gibi delik bir dizi koryon iç tabakası, kısa sürede kolayca manuall kaldırıldı koryon yumuşak dış tabaka bırakarak aşağıdaki çözünür belirmeye başlar görülecektiry Tüm kuluçka süreci 15-60 dakika sürebilir.
   
   
9. 1X BSS içeren Petri embriyolar koryon çıkıp, embriyo transferi.
   
   Pipet ucu embriyoların yavaşça rulo izin BSS yüzeye dokunarak 1X BSS kuluçka enzim aktarmak için değil emin olun.
   
   
10. Tüm embriyolar transfer kuluçka enzim sonra, 1X BSS başka bir taze çanak son bir transfer yapmak.
    
    Bu maruz kalan embriyoların zarar verecek embriyolar, kuluçka enzim herhangi bir kalıntıları maruz kalmaz sağlar. Bir kere bu son yemek koryon dış tabakası hala sahip herhangi bir embriyolar stereomicroscope altında sterilize mikro-forseps kullanarak elle kurtarılmış olabilir.
    
    Embriyolar aşağıdaki dechorionation geliştirilen gerekiyorsa, penisilin / streptomisin bakteri gelişimini engellemek amacıyla BSS ilave edilmelidir.
    
    

Şekil 1 dechorionation sırasında haddelenmiş ve kusursuz embriyolar Karşılaştırılması. Paneli B haddelenmiş embriyolar paneli A. kusursuz embriyolar görülen kıllar nasıl eksikliği dikkat edin

3. Montaj dechorionated embriyolar

Agaroz gömme, canlı embriyo görüntüleme daha uzun süre (örneğin time-lapse görüntüleme) yanı sıra sabit embriyoların ayrıntılı gözlemler için yararlıdır. Gastrulasyon ve erken organogenez (sahne sahne 28 14) sırasında, Medaka embriyoların periderm, gelişmekte olan embriyo ve yumurta sarısı ⁵ de kapsayan bir doku tabakası boyunca ritmik kasılma hareketleri dalgaları sergilerler. Embriyolar kasılma hareketleri durdurmak için ⁶ 3.5mm 1-heptanol ile tedavi edilir.

Aşamada 28 (64hpf) sonra embriyolar hareketi durdurmak için, embriyolar gömmeden önce Tricaine mesilate (TMS) ekleyerek damla anestezi. TMS (sadece az miktarda ekleyin, bu doz, yaklaşık 01:25 seyreltme optimize edilmesi gerekiyor) agaroz eklenir.

1. 37 ° C ve bu sıcaklıkta muhafaza ısıtma ile% 3 jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (1X BSS) küçük bir miktar çözülme.
2. Aşağıdaki adımları agaroz embriyo yönlendirici önce katılaşmaya olmadığından emin olmak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Eppendorf tüp kap depresyon doldurmak için geniş ağızlı bir cam pipet aktarımı yeterli erimiş agaroz kullanma.
3. BSS embriyo üzerinde taşıma kap depresyon en aza indirmek için bir dechorionated embriyo transferi. Hemen alımı kap depresyon ve bir Petri kabındaki kültür odasına transfer agaroz ve embriyo.
   
   Altındaki bir cam pencere ile 3.5cm Petri kabı kullanılır. Ters bir mikroskop kullanarak görüntüleme için, embriyolar yönelik gövde ön yüzü aşağı bakacak şekilde ve kapak cam yakın yerleştirilir. Dik bir mikroskop kullanarak görüntüleme için, agaroz kalınlığı en aza indirilmiştir.
   
   
4. 3.5cm Petri kabı, buz ve su (suyun büyük bir çanak kabaca 1 / 3 toplam derinlik doldurulur) içeren bir 14cm çaplı Petri kabı içine aktarın. Odanın alt 14cm Petri kabı sıkıca aşağı tutarken, hafifçe erimiş agaroz istediğiniz gibi embriyo yolunuzu bir saç döngüsü kullanımı ve embriyo agaroz orijinal konumuna yavaşça yükselterek daha küçük çanak ve indirme katılaşır kadar basılı tutun. buz gibi soğuk su.

4. Medaka embriyolar hücre nakli

Bu prosedürün amacı, ilgi gen hücre özerk (hücre içinde) veya olmayan hücre-otonom (hücreler arası) eylemleri belirlemek için.

Donör hücreleri nakli değerlendirme sağlayan, nakli için önce rodamin-dekstran gibi bir izleme boya (eşlik eden Jüpiter protokol 'Medaka Embriyolar Of Mikroenjeksiyon' belirtildiği gibi) veya kullanılan olabilir GFP ekspresyonu ile transgenik gerginlik etiketli olabilir. Hem etiketleme teknikleri bir arada sık sık karşılaşılan otomatik floresan üstesinden gelmek için yararlıdır. Transplantasyonundan sonra zaman atlamalı çalışmalar için, GFP ifade yararlıdır.

Bu işlem boyunca pipet pompa ile geniş ağızlı cam pipet kullanın ve% 70 ile tüm araçları (slaytlar dahil) önceden sterilize EtOH steril 1X BSS ile durulama kapsamlı izledi. Bu nakli yürüten ventral ve dorsal direkleri ayrımcılığa izin Alıcı embriyolar genellikle etrafında aşamada 12 geliştirilmiştir.

1. Enzim inkubasyon sırasında nakli ve kurulum enjeksiyon aparat önce embriyolar 1.5 saat dechorionating başlar.
2. Boşluğuna mikroskop lamı 9cm çaplı Petri kabı içine yerleştirin. % 3 metilselüloz küçük bir miktar boşluğuna steril bir pipet kullanarak slayt merkezi ekleyin ve ince yayılabilir.
3. Kuru metilselüloz yaklaşık 1-2 dakika.
4. Slayt depresyon doldurmak için steril 1X BSS 350μl ekleyin.
5. Cam bir pipet kullanarak slayt için bir donör embriyo ve dört adede kadar alıcı embriyoların transferi.
6. Embriyonun blastodermin yukarı bakacak şekilde bir saç döngü kullanarak yolunuzu embriyolar.
   
   Embriyolar daha da artması istikrar birbirlerine karşı leant olabilir.
   
   
7. Donör blastodermin ve yavaş yavaş alımı 10-20 hücreler yavaşça içine mikro iğne takın.
8. Alıcı embriyo blastodermin gerekli bölgeye hafifçe iğne yerleştirin ve hücrelerin yavaş yavaş dışarı atmak. Alıcı blastodermin hücreler ekleyerek bu embriyonun ölümüne neden olacağı gibi, hücre-yolk kesesi sınır bozmak için değil, büyük bir titizlikle alınmalıdır.
9. Sterilize 1X BSS Petri kabı içine dökün.
   
   Dikkatle BSS embriyolar bozabilir yemeğin yanında değil mümkün olduğunca yakın olarak çanak içine dökün. Embriyoların üzerine doğrudan BSS dökün ve slayt ve embriyolar dalmış olduğu gibi yeterli BSS ilave edilmemelidir.
   
   
10. Penisilin / streptomisin çanak ve kapak 100μl ekleyin. Normal gelişimi sağlamak için dikkatli bir şekilde 27 ° C inkübatör çanak aktarmak.
11. Embriyolar periyodik olarak istediğiniz gibi görülebilir. Kazanç-fonksiyonu ve / veya fenotip kurtarma deneyleri yürütmek için nakli kullanırken, görülen bazı morfolojik değişiklikler nakli etkileri nedeniyle olabilir. Böylece birden fazla transplantasyon gereklidir. 2-3 gün sonra, melanophores yolk kesesi, baş, göz ve gövde mevcut olmalıdır. Nakledilen embriyoların bulunması daha sonra başarılı bir chimera büyük olasılıkla üretilen varsa (Şekil 3).

Eğer 55 ° C 4 saat 10 dakika 94 ° C ve PCR yürütmek. 20mg/ml proteinaz K. inkübe 25μl içeren PCR tüp (ler) transfer gerekli, genotip donör embriyo (lar)

5. Temsilcisi sonuçları

Şekil 2: Örnek bir agaroz gömülü embriyonun konumu . Anterior Sağda gösterilen ve görünümü dorsal. Panel B: endotel hücreleri embriyo vücudun her iki tarafında görülebilir ve fli organizatörü tarafından tahrik GFP ile etiketlenir.

Şekil 3 transplantasyon sonrası embriyoların Görüntüler. Image hemen transplantasyon sonrası bir donör ve alıcı embriyo gösterir. Donör embriyo tamamen kırmızı blastodermin (ok) sağ tarafta gösterilmiştir. Alıcı embriyo soldaki gösterilir ve blastodermin (ok ucu) görünür kırmızı nakledilen hücrelerin küçük bir kitle tarafından kolayca tanımlanır. Resim B iki alıcı embriyolar sonrası transplantasyonu (27 ° C'de inkübe) yaklaşık 7 saat. Nakledilen hücrelerin nakli sitesinden göç etmiş ve şimdi blastodermin (oklar) dağılmış dikkat edin. Resim C st.29 (yaklaşık 74hpf) bir alıcı embriyo gösterir. Pigmentasyon, gövde ve beyin bölgesi (oklar) göz ve melanophores varlığını unutmayın. Rodamin etiketli hücrelerin embriyonik yapıların bir kabus başarılı bir üretim olduğunu gösteren birçok kolonize görülebilir.