Bicyclus anynana pupa kanat dokusu gen ekspresyonu incelemek için, riboprobes kullanarak yerinde döllemeler için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Biz de bu protokolün diğer lepidopteran türlerin pupa kanatları kullanmak için daha fazla optimizasyon için yönergeler sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü
Bu makalede
Özet
Özet
Burada, video formatı, riboprobes kullanarak kelebek Bicyclus anynana pupa kanatları in situ döllemeler için bir protokol mevcut. Yerinde döllemeler, gelişim biyolojisi bir dayanak noktası, transkripsiyon düzeyinde, gelişmekte olan dokularda gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desen çalışması için faydalıdır. Gen transkripsiyonu ve protein ürünleri hedef alan antikorlar henüz geliştirilen ve / veya mevcut antikorlar kullanılarak ayırt edilemez genomunda belli bir protein birden fazla gen kopyaları bulunmaktadır edilmemiştir varsa, situs yerine kullanılabilir. Larva kanat diskler için yerinde teknik bir kaç yıl için kelebek topluluk olmasına karşın, mevcut protokol daha büyük ve daha kırılgan bir pupa kanatlar için optimize edilmiştir.
Protokol
1. GÜN
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- GKD 2 O
- % 0.1 'lik toplam hacmi DEPC ekleyin ve şiddetle çözümler sallamak.
- Otoklav.
- % 4 Paraformaldehit Fix - PBS-DEPC
- Proteinaz K çözüm çökelti varsa, vorteks şiddetle kısım çıkarmadan önce
- Sindirim Durdur Tamponu
- Prehybridization Tampon
- 50:50 PBT: Prehybridization Tampon
- Hibridizasyon Tampon
- Çözümler RNaz ücretsiz tutulmalıdır. Ya da pişmiş cam eşya (4 saat 250 ° C) ya da atılabilir plastik kullanın. Serolojik pipetler çözümleri yapmak için çok kullanışlıdır
- PBS içinde kanatları teşrih zaman aşamalı pupa
- Oda sıcaklığında 24 kuyu kültür plaka kuyularda Tampon saptamak için doğrudan kanatları hareket ettirme
- 2 saat için diskler Fix
- PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın
- Proteinaz K çözüm, 3 dakika boyunca kanatları inkübe
- Sindirim Durdur Tamponu 2 x durulayın
- PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın
- 50:50 PBT 2 x 5 dakika Yıkama: PHB
- PHB olarak 1 x 10 dakika yıkayın
- PHB en az 1 saat inkübe 55 ° C.
- Isı doğasını RNA prob (20 50ng de her ihtiyaç) (80 ° C 5 dakika) ve hibridizasyon tamponu (ul 100 de ortalama gerekli)
- Kuyulara prob ekleyin ve 55 az 48 saat inkübe ° C
3. GÜN
- 4 x 5 dakika yıkayınız 55 ° C PHB
- 55 PHB gece inkübe ° C
4. GÜN
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- Antikor Blok Tamponu
- PHB: 50:50 PBT 1 x 5 dakika yıkayın
- PBT içinde 4 x 5 dakika yıkayın
- 4 Blok Tampon 1 saat inkübe kanatları ° C
- 4 geceleme anti-Kazı antikor 1:2000 dilüsyon kanatları inkübe ° C
5. GÜN
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- Algılama Tampon
- Gelişmekte olan Çözümü - ışığa karşı hassastır (folyo ile sarın)
- Oda sıcaklığında PBT 3 x 5 dakika yıkayın
- PBT yıkayın 7 x 5 dakika
- Algılama Tampon kanatları iki kez durulayın
- Çözüm Geliştirme 1 ml kanatları geliştirin gelişme zamanı her zaman kontrol edilmelidir gelişmekte kez aynı probları ve gelişmekte olan çözümü kullanırken bile değiştirebilirsiniz genellikle gecede aralıklarla kadar artırmaya sonra 5-10 dakika sonra kontrol edin ve. Plaka örnekleri kontrol ışığa maruz önlemek için folyo sarılı olmalıdır.
- Gelişmekte olan Durdur Tampon beş kez durulayın
- Kanatları Dağı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mevcut protokollerin optimizasyonu
Larva kanat disklerine yerinde döllemeler başarıyla Precis coenia kelebekler diskler kullanılarak yapılmıştır (Carroll ve ark 1994; Keys ve ark 1999; Weatherbee ve ark 1999). Protokolü larva kanat renklendirmeler Carroll Lab isteği üzerine ayrıntılı bir yazılı protokol adapte edilmiştir. Yapılan değişiklikler, larva ve pupa kanat dokular arasındaki farklılıkları barındırmak için hizmet vermektedir. Pupa hindwing diseksiyonlar sırasında peripodial membran kuyuları dahil edilmelidir. Protokolünde ilk...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Biz Jayne Selegue Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadiç Bob Reed, Roche Teknik Destek Bu protokol sorunları giderme konusunda yardım için teşekkür ederim. Biz de film düzenleme William Piel tavsiye için teşekkür ederim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Fiksasyon Tamponu | PBS içinde %4 Paraformaldehit | |||
| PBT | PBS içinde %0.1 Tween 20 | |||
| Proteinaz K çözeltisi | PBT içinde 2.5mg/ml Proteinaz K | |||
| Sindirim Durdurma Tamponu | PBT içinde 2 mg/ml glisin | |||
| Pre-Hibridizasyon Tamponu | 50 ml PHB için: 12 ml DEPC işlem görmüş su + 25 ml Formamid + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml somon spermi (Rnase içermeyen, çözeltiye eklenmeden önce ısı ile denatüre edilmiş). | |||
| Hibridizasyon Tamponu | Pre-hibridizasyon tamponuna 1 mg/ml glikojen ekleyin | |||
| Bloklama Tamponu | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, %0.5 IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkalin Fosfataz konjuge |
| DIG Yıkama ve Bloklama Tampon Seti | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Kapatma Mediumu |
Kaynaklar
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
