Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş olabilir In vitro Uyumluluklar değişen poliakrilamid hidrojeller.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Doku sertliği hücresel fonksiyonunun önemli bir belirleyicisi olup, doku sertliği değişiklikler yaygın fibrozis, kanser ve kardiyovasküler hastalık 1-11 ile ilişkilidir. Geleneksel hücre biyolojik yaklaşımlar hücresel fonksiyonu çalışmalarında elastik bir ECM ya da dokular arasında ECM sertlik değişikliklerin etkisini dikkate almaz, katı bir alt tabaka üzerinde kültür hücreleri (plastik tabaklar ya da cam lamelleri) içerir. In vitro, in vivo doku uyumu şartları model için, biz ve diğerleri ECM-kaplı hidrojeller kullanın. Laboratuvarımızda, hidrojeller dizi 12 biyolojik olarak görülen doku uygunluk bildirimleri taklit edebilir poliakrilamid dayanmaktadır. "Reaktif" kapak fişleri 3-APTMS Ayrıca NaOH ile kuluçka tarafından üretilir. Glutaraldehyde 3-APTMS ve poliakrilamid jel çapraz bağlamak için kullanılır. Akrilamid (AC), bis-akrilamid (Bis-AC) ve amonyum persülfat bir çözüm hidrojel polimerizasyon için kullanılır. N-hydroxysuccinimide (NHS), hidrojel çapraz ECM protein AC çözüm içine dahil edilmiştir. Hidrojel polimerizasyonu sonra jel yüzeyi, fibronektin, vitronectin, kollajen, vb gibi bir seçim ECM protein ile kaplıdır
Bir hidrojel sertlik reoloji veya atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından belirlenir ve çözüm 12 AC ve / veya bis-AC yüzdesi değişen ayarlanabilir. Bu şekilde, alt tabaka sertlik reoloji veya AFM kullanılarak belirlenebilir Biyolojik dokuların sertlik eşleştirilmiş olabilir. Hidrojeller ve kültürlü gerekli deneysel koşullar dayalı bu hücreler daha sonra numaralı seribaşı olabilir. Moleküler analiz için hücre ve onların kurtarma Görüntüleme basittir. Bu yazı için, yumuşak katmanlarından 20.000 Pascal <E 3000 Pascal ve sert doku katmanlarından /> elastik modülü (E) olarak tanımlar.
Protokol
Hazırlık
- Lameller otoklava olmalıdır.
- Steril distile veya deiyonize su çözümler hazırlamak ve çamaşır lamelleri için kullanılmalıdır.
- AC (% 40 w / v) ve bis-AC (% 1 w / v) çözümleri 0.2 mikron filtre ile sterilize edilir. Kullanımı ve steril filtre kısa bir süre önce,% 10 amonyum persülfat (100μg/ml su APS) hazırlayın. APS çözüm aylık değiştirin.
- 3-APTMS, kloroform, glutaradehyde, NHS ve SurfaSil gibi kimyasal reaktifler otoklavlanmalıdır sadece hidrojellerin hazırlanması için kullanılan atanmış bir şişe içinde tutulur.
- En iyi sonuç için, hidrojeller uygun ECM protein ile geceleme inkübasyondan sonra birkaç gün içind....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hidrojel polimerizasyon işlemi çok önemli bir unsur hücreleri ECM-kaplı hidrojel kendini daha ziyade cam lamel bağlamak sağlayacak hava kabarcığı oluşumunu önlemek için. Bu vorteks ve görsel hiçbir hava kabarcığı jel tuzak haline emin sonra dikkatli bir şekilde polimerizasyon çözüm pipetleme önlenebilir. Biz her zaman deneyler için yeterince sağlamak için ek "reaktif" lamelleri ve hidrojellerin hazırlanması önerilir.
Jeller PBS ile yıkanır zaman özellikle dikkat edilmelidir. Hidroj.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
İş bizim laboratuar Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Glutaraldehit, %70 | Sigma-Aldrich | G7776 | -20°C'de saklayın |
| 3-APTMS (3-Aminopropiltrimetoksisilan %97) | Sigma-Aldrich | 281778 | Oda sıcaklığında saklayın |
| SurfaSil Silikonlama Sıvısı | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Oda sıcaklığında saklayın |
| NHS (N-hidroksisuksinimid Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | 4°C'de saklayın, aylık olarak yenileyin |
| Albumin, sığır serumu, esasen yağ asidi içermeyen | Sigma-Aldrich | A6003-100G | 4°C'de saklayın |
| Lamel (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Lamel (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
Kaynaklar
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
