$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. WEC sistemi kurmak
- Ortak WEC sistemi içinde giriş silikon tüp filtre 0.22 mikron membran).
- O 2 (% 95) ve CO 2 (% 5) içeren bir gaz silindir valfini açın. Otoklava su içeren köpürme şişe ile davul içine gaz karışımı akış.
- Gaz karışımı akışını hacmi 50 cc ayarlayın.
- Dışında bir su şişesi içine silikon tüp izin ve gaz karışımı akışını kontrol yerleştirin.
- 20 dev / dak hızında davul döndürün.
2. Kültür ortamı hazırlanması
- 37.0 çözülme sıçan hemen santrifüje (IC) serum ° C b). Otoklavlanmış 100 ml beher çözülmüş serum içine ekleyin D-glukoz (2 mg / ml). Kültür orta birincil kültür seviyesi (örneğin, bir başlık kullanarak) hazırlanmalıdır.
- 400 seyreltme: 1 ile serum antibiyotik antimikotik (100X) sıvı ekleyin.
- Kalan izofluran buharlaşacak (sıçanlarda kan toplama sırasında anestezi nedeniyle), oda sıcaklığında (RT) c) 20 dakika serum .
- 0.45 mikron membran filtre kullanılarak kültür ortamı sterilize edin.
- Her kültürün şişe, orta 3,0 ml dökün ve alüminyum folyo kaplı bir silikon fişi ile her şişe üst, mühür (ref 14) d).
- Tyrode en tuzlu e içeren üç ya da dört bertaraf Petri kapları hazırlayın).
3. Anestezi, rahim sıçan ve izolasyon
- Parenteral veya inhalasyon anesteziklerin derinden zamanlanmış bir gebe sıçan anestezisi.
- % 70 etanol ile anestezi gebe sıçan karın bölgesini temizleyin.
- Forseps ile cilde Pick up ve) büyük makasla f cilt keserek karın duvarı exteriorize.
- Forseps bir çift ile karın duvarı Pick up) torasik düzeyde g büyük makas ile karın duvarı U-şekilli büyük uzunlamasına insizyonlar makyaj.
- Forseps bir çift ile sol tarafına uzak Bear bağırsak ve rahim, yumurtalık bağlı bir ucunu göstermek.
- Forseps bir çift rahim sonuna Pick up ve büyük makas ile rahim ve yumurtalık arasındaki konumunu kesmek.
- Gebe sıçan rahim, rahim diğer sonuna kadar rahim çevresindeki yağ keserek çıkartın.
- Tyrode Kullanıcı tuzlu su içeren Petri rahim aktarın.
- Rahim çıkardıktan sonra anesteziklerin aşırı idaresi veya servikal dislokasyon sıçan Euthanize.
4. Embriyolar rahim çıkarılması
- Kısaca yıkayın ve Tyrode Kullanıcı salin rahim), ince forseps h bir çift ile ikinci Petri kabı transfer .
- Binoküler mikroskop altında, ince forseps bir çift rahim duvarına pick up ve oftalmik düz makas kullanarak kan damarları ile bağlantı mesometrium karşı tarafında rahim duvarına kesmek.
- Rahim duvarı ve desidua arasında uzaya oftalmik düz makas ucu takın. Rahim duvarına boydan boya antimesometrial kenarı boyunca kesin.
- Mesometrial tarafında desidua ve ince forseps i) iki çift rahim ayrı conceptuses tutam.
- Uygun bir çapa sahip bir steril cam pipet ile üçüncü Petri kabı conceptuses aktarın.
5. Rat embriyoları diseksiyonu
- Desidua microforceps bir ucu takın ve iki çift forseps ile konseptus etrafında desidua enine bir kesi yapmak.
- Plasenta tarafında desidua forseps ipuçları takın ve üst için desidua iki uzunlamasına insizyonlar yapmak.
- Bu iki çift forseps ile ripping tarafından plasenta tarafında desidua çıkarın. Iki çift forseps ile kalan desidua çıkarın.
- Reichert membranı Alış üzerinde yatay bir kesi yapmak ve anti-plasenta tarafında konseptus membran ayrı.
- Forseps iki çifti ile yolk kesesi embriyo kafa yakın küçük bir delik açın ve oftalmik kavisli makas bir çift ile yolk sac kesme. Büyük kan damarlarının zarar vermemek için çok önemlidir.
- Embriyo başının etrafında yerinde iki çift ince forseps amniyon Pick up ve hafifçe), amniyon h yırtılma yolk kesesi embriyo çekin . Embriyonun vücut midgestation aşamada embriyo için oksijen kaynağı artırmak için yumurta sarısı kesesi dışarı çekilmelidir.
6. Tüm embriyo kültürü
- Plasenta, yolk kesesi, kalp dayak ve kan dolaşımı durumu zararlar kontrol edin.
- Göbek kordonu uzanan farkında olmak, transfer, steril bir cam pipet ile bir kültür şişe embriyo. Tyrode Kullanıcı tuzlu su kültürü şişeleri üzerinde taşır, mümkün olduğunca az olmalıdır.
- Rotator davul delik olmayan bir silikon fişini çıkartın. WEC sistemi rotator davul dik bir deliği olan bir eklenti ile kültür şişe bağlayın. Rotator davul çok ince bir ekipman olduğundan olumsuz yönde davul tarihinde yürürlüğe koymak için dikkatli olun. Disseke embriyo içeren şişeler tek kültür tek aktarılır; kuluçka ön kapının açılması) kuluçka sıcaklığı önlemek için j azalma minimize edilmelidir.
- Kültür 10 saat sonra, 24 saat sonra (Tablo 1) gaz karışımı akış hacmi 75 cc ve 100 cc kadar varan artış.
- Kültür ortamı, yeni bir kültür ortamı ile taze hazırlanmış şişeye kültürlü embriyo transfer ederek 24 saat etrafında değiştirilmesi gerekir. 34 saat sonra 125 cc akış hacmini artırmak ve 48 saat sonra 150 cc (Tablo 1)
- Bazen, kalp atışı hızı (yani, 120-150/min optimum) sayarak ve kan dolaşımını gözlemleyerek kültürlü embriyoların durumunu kontrol edin. Gerekirse Tyrode Kullanıcı salin embriyoların büyüme yargılamak için Somitlerin sayısını. Normal bir gelişme olarak, bir iki saat hücre gruplarının eklenir.
- WEC bittiğinde, gaz karışımı kaynağı durdurmak ve giriş borusu ve köpürme şişe giriş tüpe geri akışı önlemek için filtre membran kesmek.
7. Notlar
- WEC sistem içinde sıcaklığı sürekli 37,0-37,5 ° C tutulur
- Sıçan ve fare embriyoları WEC% 100 sıçan IC serum rutin olarak kullanılan ve kullanımdan önce -20 ° C'de muhafaza edilir.
- Biz sıçan IC serum, izofluran anestezisi sıçan toplanan satın alın.
- Tek kullanımlık şişe Ikemoto Rika da mevcuttur. Şişeler ve silikon fişler otoklava olmalıdır.
- Diseksiyon sırasında embriyoların düşük ya da yüksek ısıda muhafaza WEC sonraki gelişimini etkileyebilir, çünkü embriyo Diseksiyon RT yapılmalıdır.
- Diseksiyon için Araçlar kuru ısı ile sterilize edilir.
- Deri ve karın duvarı, mümkün olduğunca bir çanak içine kılların bulaşmayı önlemek için ayrı ayrı kesilmesi gerekir. Biz deri kestiğiniz zaman onlara yeni bir çift ile bir çift büyük makas ve forseps değiştirmek ve sırasıyla rahim izole.
- Ipuçları ince forseps kullanılması kesinlikle dokuları incelemek için çok önemlidir. Biz bir taş ve makine yağı ile elle forseps ipuçları keskinleştirmek.
- Biz embriyoların aşırı basıncı önlemek için forseps bir tarafında bir bıçak gibi kullanın.
- WEC sistemi içindeki sıcaklık, tekrar tekrar kapıyı açarak düştüğünde, ışığı açmak için sistem içinde sıcaklıkta tutmaya devam ediyor.
8. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1, rat embriyo ve kültürlü sıçan embriyolar diseksiyon prosedürleri gösterir.
Şekil 1 E12.5 rat embriyo Tüm embriyo kültürü. (A) konseptus gebe sıçan rahim disseke. (B) plasenta tarafında desidua kaldırılması. Reichert membranı (C) Kaldırma. (D) yolk kesesi açılması. (E) WEC başından sonra 6 saat süreyle şişe rat embriyo kültür. (F) sıçan 42 saat için embriyo kültür. d desidua; R Reichert Kullanıcı membran, p, plasenta, ys, yolk kesesi, e, embriyo.
| 0 saat | 12 saat | 24 saat | 36 saat | 48 saat |
| E12.5 rat embriyo | % 95, 50 cc | 95% 75 cc
(10 saat) | % 95 100 cc | % 95 125 cc (34 saat) | % 95 150 cc |
Tablo 1. Optimal oksijen durumu.