Method Article

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

DOI:

10.3791/2220

⸱

December 21st, 2010

 ,  , 
1Department of Biology, Portland State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA hasarı varlığı Yanlış çoğaltma ve yaygın olarak insanlarda kanser gelişimi ile doğrudan ilişkili olduğuna inanılan tüm hücre tiplerinde gözlenen hücresel düzenlenmeleri ve mutagenez çoğunluk için sorumludur. DNA hasarı, UV ışını ile indüklenen gibi ciddi doğru genomik şablonu çoğaltmak çoğaltma yeteneğini bozar. Bir dizi gen ürünleri çoğaltma şablon DNA lezyonlar karşılaştığında gerekli olduğu tespit edilmiştir. Ancak, kalan meydan çoğaltma sırasında bu proteinlerin nasıl süreci lezyonları belirlemek olmuştur

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Büyüme ve UV Işınlama.

  1. Şekeri% 0.4,% 0.2 casamino asitler, ve 10 mg / ml timin (DGCthy orta) ve 100 mg / ml ampisilin ile desteklenmiş Davis orta 1 yetiştirilen plazmid pBR322 içeren taze bir gece kültür 200μl pelet. Hücre pelletini sonra ampisilin eksik 200μl DGCthy orta yeniden bekletildi ve 20 ml DGCthy orta aşılamak için kullanılır.
  2. Kültürler 0.5 OD 600 (~ 5 x 10 8 hücre / ml) 37 sallayarak inkübatör ampisilin seçimi ° C olmadan yetiştirilmektedir. Büyüme ampisilin olmadan bazı mutantlar ortaya çıkabilecek anormal veya verimsiz çoğaltma ara karşı seçimi önler. Hasara neden UV ışık kullanıyorsanız, UV etkili....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UV hasarına varlığı ve yokluğu vahşi tip hücreler elde edilen tipik sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Hasar yokluğunda, hücreler üstel fazda hızla büyüyor ~% 1, toplam plazmid DNA Y ark. Bloke çoğaltma çatal hasarlı siteleri biriktikçe ışınlama takiben, Y şekilli moleküllerin geçici bir artış görülmektedir. X-şeklinde çoğaltma ara lezyonlar tamir ile ilişkilendiren bir saatine kadar geçici olarak birikir ve devam.

Güney analizi yerine, çoğaltma ara, saflaştırılmış bir plastik içme sama.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuarımızda NIGMS-Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı ve ALANI hibe R15GM86839 KARİYER ödül MCB0551798 tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GE HealthcareG15T8Yellow Lightingmu'nun Güney analizine bir örnek
; watt antiseptik lambaSylvaniaF20T12 / GOUV Lambası
Blak-Ray UV Yoğunluk Ölçer 254nmDaiggerEF28195TUVC fotometre
0.025 & mu; m gözenekli disklerWhatman, GE HealthcareVSWP04700Yüzer diyaliz diskleri
PvuIIFermentasER0632Kısıtlama Endonükleaz
Nick-çeviri kitiRoche Group97677632P etiketli prob
yapmak için Kurutma KağıdıWhatman, GE Healthcare3030-704Güney transferi
için Naylon membranGE HealthcareRPN203SGüney transferi için
2D jel problu 15 &

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
  2. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two dimensional Gel ElectrophoresisDNA Replication IntermediatesUV induced DNA DamagePlasmid PBR322 AnalysisAgarose Gel AnalysisSouthern BlottingRestriction Enzyme DigestionAlkali Transfer SystemReplication Fork ReversalNucleotide Excision Repair

Related Articles